疯草内生真菌Undifilum oxytropis次级代谢产物分析

薛瑞旭，权海云，任祯慧，路　浩，赵宝玉

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)



疯草内生真菌Undifilum oxytropis次级代谢产物分析

薛瑞旭，权海云，任祯慧，路浩，赵宝玉*

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

摘要：为阐明疯草内生真菌Undifilum oxytropis次级代谢产物的化学组成，为其生物活性研究和开发利用提供依据，以本实验室保存的疯草内生真菌Undifilum oxytropis为研究菌株，采用察氏液体培养基对该菌发酵培养30 d，收集菌丝体和发酵液，按照植物化学成分传统预试方法进行预试。在此基础上用不同极性有机溶剂梯度萃取得到菌丝体和发酵液石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相和正丁醇相，经薄层色谱检测及气相检测方法对其次级代谢产物进行初步分析。系统预试表明，Undifilum oxytropis发酵产物中含有生物碱、蛋白质、酚类与鞣质、黄酮类、醌类、挥发油和油脂等物质；薄层色谱检测发现，Undifilum oxytropis发酵产物中至少含有5种化合物，且菌丝体和发酵液正丁醇相均有苦马豆素及其类似物存在；气相色谱分析Undifilum oxytropis发酵液中苦马豆素含量为5.17×10-3g/L。疯草内生真菌Undifilum oxytropis发酵产物含有苦马豆素等多种次级代谢产物。

关键词：Undifilum oxytropis；苦马豆素；次级代谢产物；内生真菌；疯草

疯草(locoweed)是含苦马豆素(swainsonine，SW)并可引起动物典型疯草中毒神经症状和病理学变化的棘豆属(Oxytropis)和黄芪属(Astragalus)有毒植物的统称[1]。动物采食后会引起神经系统疾病 “疯草病(Localism)”或“绵羊猝狙(Peastruck)”。早在1984年，Tulsiani D R等[2]首次证明疯草的毒性物质主要是苦马豆素。毒理学研究表明，苦马豆素可抑制哺乳动物细胞内溶酶体α-甘露糖苷酶和高尔基体甘露糖苷酶Ⅱ的活性，引起细胞内低聚糖代谢和糖蛋白合成障碍，导致细胞空泡变性和组织器官功能紊乱。在过度放牧的退化草地，疯草因其抗逆性强形成优势种群，成为世界范围内制约草地畜牧业健康发展的最严重有毒植物。正当人们苦恼该如何遏制疯草肆虐时，1985年Hino等意外发现苦马豆素有抗肿瘤活性，而且在免疫调节等方面也有一定的优势，从此引起众多学者对其药用价值的关注。大量研究表明，苦马豆素不仅能抑制肿瘤细胞的生长和转移、诱导细胞凋亡，还能刺激机体免疫系统，增强杀灭肿瘤细胞的能力，目前已进入Ⅲ期临床应用阶段[3-6]。

目前，苦马豆素纯品因植物提取周期长、效率低和人工合成工艺复杂、纯化难度大等原因，导致苦马豆素价格极其昂贵，高达1 400元/mg，严重制约着苦马豆素抗癌活性研究的深入。2003年Braun K等[7]从疯草植物中分离到Undifilumoxytropis，体外培养发现该菌能够产生苦马豆素，且感染浓度与宿主植物中苦马豆素浓度高度相关。国内学者也从甘肃棘豆、冰川棘豆、小花棘豆等7种疯草类有毒植物中分离到该菌，且通过气相色谱检测发现能够产苦马豆素；此外，国内外学者也从豆类丝核菌(Rhizoctonialeguminicola)及金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)发酵产物中检测到苦马豆素。研究证明豆类丝核菌自然干燥菌丝体中苦马豆素含量达到12.3 mg/g～29.9 mg/g[8]，金龟子绿僵菌干燥菌丝体和发酵液中苦马豆素含量分别为2.26 mg/g和11.21 mg/L[9]。这些系列研究为进一步拓宽苦马豆素的来源，特别是利用微生物发酵生产成苦马豆素为一种可能。

因此，本试验在课题组前期疯草内生真菌多样性及其产苦马豆素内生真菌筛选研究的基础上，利用本实验室从甘肃棘豆中分离鉴定的疯草内生真菌Undifilumoxytropis为研究对象，通过对其发酵液和菌丝体次级代谢产物化学成分的初步分析，阐明疯草内生真菌Undifilumoxytropis次级代谢产物的种类，以期为今后Undifilumoxytropis发酵生产苦马豆素工艺优化及其次级代谢产物活性研究提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株Undifilumoxytropis菌株由西北农林科技大学动物医学院毒理学实验室提供(中国工业微生物菌种保藏管理中心菌种保藏专利号为CICC2493)。

1.1.2主要试剂苦马豆素标准品由西北农林科技大学动物医学院毒理学实验室提供(植物提取，气相标定纯度98%)；PDA培养基和改良察氏发酵培养基，Czapek’s公司产品；吡啶(AR)，国药集团产品；BSTFA+TMCS硅烷化试剂，百灵威科技有限公司产品；硅胶GF254，青岛海洋化工产品；其他常规有机试剂均为国产分析纯。

1.1.3主要仪器GC-14C气相色谱仪，日本岛津公司产品；威玛龙色谱数据工作站；AT.SE-54型毛细管色谱柱30 m×0.25 mm，中国科学院兰州化学物理研究所色谱技术研究开发中心提供；BL6100电子天平，德国Sartorius公司产品；Lab Tech旋转蒸发仪，北京莱伯泰科仪器有限公司产品；ZWY-2102C双层恒温摇床，上海智诚产品；循环水式多用真空泵，郑州长城工贸公司产品；HPS-250 生化培养箱，东联电子技术开发有限公司产品；ZF-2三用紫外仪，上海市安亭电子仪器厂生产。

1.2方法

1.2.1Undifilumoxytropis的活化及发酵培养将保藏菌株Undifilumoxytropis采用“尖端挑取法”接种至PDA培养基，25℃培养7 d，再将5 mm菌饼接至Czapek’s[10]液体培养液中进行发酵培养，条件为室温(25℃)、转速为150 r/min，时间为30 d。发酵完成后，减压抽滤分离菌丝体和发酵液。发酵液减压浓缩成浸膏；菌丝体45℃烘干后研钵研磨至粉末状，置于4℃保存备用。

1.2.2Undifilumoxytropis发酵产物化学成分系统预试制备Undifilumoxytropis发酵产物(菌丝体和发酵液混合物)醇提液、水提液及石油醚提取液，用常规试管预试验方法初步检测所含化学成分种类。

1.2.3Undifilumoxytropis发酵产物的提取与分段萃取菌丝体粉末用10倍量工业酒精超声提取3 h，收集上清，重复3次后合并上清液，减压浓缩至浸膏。发酵液和菌丝体浸膏分别采用适量甲醇加热溶解，置4℃过夜，抽滤后得上清，重复3次后合并醇提液。将醇提物中醇挥干后加水分散，按照传统植物化学成分预试方法从极性由低到高依次采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇进行分段萃取，重复操作直至相邻两次上清颜色无明显差别，减压浓缩分别得到菌丝体和发酵液石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相和正丁醇相。

1.2.4Undifilumoxytropis各萃取相薄层色谱检测分别取菌丝体和发酵液石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相和正丁醇相浸膏少许，用适量甲醇溶解，毛细管点样于GF254薄层硅胶板上，上行法展开，待溶剂前沿距薄层板上端1 cm处取出，挥干展开剂，先在254 nm紫外光下观察有无荧光，再用显色剂显色，记录各斑点颜色及Rf值。

1.2.5Undifilumoxytropis发酵液正丁醇萃取相苦马豆素气相色谱(GC)检测

1.2.5.1苦马豆素标准曲线的绘制具体过程同吴晨晨等[11]。

1.2.5.2样品前处理与苦马豆素含量测定取发酵液正丁醇相浸膏0.048 7 g用吡啶超声提取30 min，共提取3次，每次20 μL，合并上清后离心，得到吡啶上清液约60 μL；取其中50 μL上清液加入20 μL TMCS混匀，60℃反应30 min后2 μL进样，色谱条件同1.2.5.1。将测定结果带入苦马豆素质量浓度-峰面积线性回归方程，计算出吡啶溶液中苦马豆素的质量浓度(ρ)，再根据以下公式(x=ρ(g/L)×V吡啶(L)/V总发酵液(L)计算出Undifilumoxytropis发酵液中苦马豆素含量x(g/L)。

2　结果

2.1Undifilum oxytropis发酵产物系统预试结果

通过系统预试初步确定Undifilumoxytropis发酵产物中主要含有生物碱、蛋白质、酚类与鞣质、黄酮类、醌类、挥发油、油脂等物质，不含有皂苷、强心苷、有机酸等物质，结果见表1。

2.2Undifilum oxytropis发酵产物各萃取相薄层色谱检测结果

Undifilumoxytropis菌丝体各萃取相检测结果见表2。石油醚相50 mL/L硫酸乙醇显色出现4个紫色斑点，表明至少含有4种物质；氯仿相50 mL/L硫酸乙醇显色出现3个紫色斑点，表明至少含有3种物质；乙酸乙酯相50 mL/L硫酸乙醇显色出现1个紫色斑点，在相同位置改良碘化铋钾显色呈橙红色，表明至少含有1种生物碱；正丁醇相50 mL/L硫酸乙醇显色出现2个深棕色斑点，Ehrlich’s 试剂显色出现2个紫红色斑点，表明至少含有3种物质。在同一展开条件下，Rf值及斑点颜色均无显著差异的化合物可能是同种或者同类物质，更为重要的是本次试验菌丝体正丁醇相Ehrlich’s显色呈阳性，表明菌丝体中的确有苦马豆素及其类似物存在(图1)。

表1　Undifilum oxytropis发酵液和菌丝体化学成分系统预试结果

Undifilumoxytropis发酵液各萃取相检测结果见表3。石油醚相50 mL/L硫酸乙醇显色出现2个斑点，表明至少含有2种物质；氯仿相5%硫酸乙醇显色出现2个墨绿色斑点，表明至少含有2种物质；乙酸乙酯相50 mL/L硫酸乙醇显色出现1个紫色斑点，在相同位置改良碘化铋钾显色呈橙红色，表明至少含有1种生物碱；正丁醇相50 mL/L硫酸乙醇显色出现2个深棕色斑点，Ehrlich’s 试剂显色出现3个紫红色斑点，表明至少含有4种物质。在同一展开条件下，Rf值及斑点颜色均无显著差异的化合物可能是同种或者同类物质，本次试验发酵液正丁醇相Ehrlich’s显色出现3个阳性斑点，表明发酵液中的确有苦马豆素及其类似物存在(图1)。

2.3Undifilum oxytropis发酵液正丁醇萃取相苦马豆素气象色谱检测结果

2.3.1苦马豆素标准曲线的绘制通过系列质量浓度梯度苦马豆素标准品的GC分析，发现苦马豆素出峰时间稳定在4.13附近，对苦马豆素标准品质量浓度(x)、峰面积(y)进行线性回归分析，得到回归方程：y=25 474x(R2=0.996)，其标准曲线如图2。

表2　Undifilum oxytropis菌丝体各萃取相TLC检测结果

表3　Undifilum oxytropis发酵液各萃取相TLC检测结果

1.苦马豆素标准品； 2.菌丝体正丁醇相； 3.发酵液正丁醇相

1.SW standard； 2.Butanol phase of mycelium； 3.Butanol phase of broth

图1Undifilumoxytropis菌丝体和发酵液

正丁醇相TLC检测色谱图

Fig.1TLC results ofUndifilumoxytropismycelium and broth butanol phase

图2　苦马豆素质量浓度-峰面积标准曲线

2.3.2Undifilumoxytropis发酵液正丁醇相GC分析由图3和图4可知，苦马豆素标准品和检测样品中苦马豆素的出峰时间都为4.13，由此可以准确证实Undifilumoxytropis发酵液正丁醇相中确实含有苦马豆素。由2.3.1得出的苦马豆素质量浓度-峰面积线性回归方程，计算出吡啶溶液中苦马豆素的质量浓度(ρ)为4.55 g/L，进而得出发酵液正丁醇中苦马豆素含量(x)为5.17×10-3g/L。

3　讨论

截至目前，多种抗肿瘤物质如紫杉醇、喜树碱、长春新碱等药物已被人们广泛利用，但副作用的存在也迫使科学家积极寻求毒性较小的替代药物。苦马豆素的问世给医学界带来了希望，已知苦马豆素具有多种生物活性，且其抗肿瘤I和IB期试验已完成[12-13]，目前正进行Ⅲ期临床试验。加拿大Inflazyme和日本Astellas公司分别研制出“盐酸苦马豆素”和免疫调节剂苦马豆素在多个国家授权许可。国内“棘豆扶正胶囊”的使用也对270例重症癌症患者临床治疗起到了较好的疗效。目前，该生物碱苦马豆素可通过人工合成[14-17]、植物提取[18-21]及生物合成[22-24]获得，然而人工合成通路复杂且收率低，植物提取率较低且草场破坏率较高，而生物合成由于发酵工程的迅速发展成为了目前生物活性物质获取的主流方式。

图3　苦马豆素标准品GC色谱图

图4　Undifilum oxytropis发酵液正丁醇相GC色谱图

在本试验中，系统预试结果显示发酵产物中含有多种活性物质，这与张宇等[25]的结论有一定差异，一方面可能培养基中有机成分的不同对代谢物存在促进或抑制作用，甚至引发物质转化，另一方面是发酵时间及菌株所处状态不同也会对代谢产物有影响[26]。另外，提取中物质损耗导致低于物质最低检测限也会造成结果差异。除一般化学成分探索外，苦马豆素生物合成一直都是个谜，2010年，Mukherjee S等[27]成功构建了Undifilumoxytropis原生质体及非瞬性转化体系。随后他们将该菌中酵母氨酸还原酶基因序列中断后苦马豆素水平有所上升，证实该序列参与苦马豆素代谢[28]。国内张蕾蕾等[29-30]也对此进行了初步的探索。本试验TLC分析发现Undifilumoxytropis发酵产物中有多种化合物存在，而且Rf值及斑点颜色综合对比后发现有些化合物同时存在于菌丝体和发酵液中。更重要的是菌丝体和发酵液正丁醇相中均有苦马豆素存在，且发酵液中苦马豆素显色斑点较深，这可能源于苦马豆素极性大，极易溶于水，菌丝体中合成后溶于发酵液而形成的。同时在发酵液中还存在苦马豆素类似物，这与之前疯草类植物提取物TLC检测结果有相似之处[31]，由此推断这些苦马豆素类似物可能参与了苦马豆素生物合成，为苦马豆素是真菌源生物碱提供了理论支持，但该菌中苦马豆素生物合成通路研究还需进一步深入开展。

本试验结果表明，Undifilumoxytropis发酵产物中主要含有生物碱、蛋白质、酚类与鞣质、黄酮类、醌类、挥发油、油脂等物质，而且发酵液和菌丝体中均有苦马豆素及其类似物，GC测定Undifilumoxytropis发酵液中苦马豆素含量为5.17×10-3g/L，是疯草类有毒植物中苦马豆素含量的几倍。因此，对Undifilumoxytropis进行发酵条件优化将有望确定该菌高产苦马豆素的最佳培养条件，进而为大批量发酵生产苦马豆素提供理论基础。

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动物医学进展,2016,37(7):71-75ProgressinVeterinaryMedicine

收稿日期：2016-02-13

基金项目：农业部“十二五”公益性行业(农业)科研专项(201203062)

作者简介：薛瑞旭(1991-)，女，山西吕梁人，硕士研究生，主要从事疯草内生真菌次级代谢产物研究。*通讯作者

中图分类号:S856.9

文献标识码:A

文章编号:1007-5038(2016)07-0064-07

Analysis of Secondary Metabolites ofUndifilumOxytropisfrom Locoweeds

XUE Rui-xü,QUAN Hai-yun,REN Zhen-hui,LU Hao,ZHAO Bao-yu

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China)

Abstract:To clarify chemical composition of secondary metabolites and provide evidence for biological activity studies and application of Undifilum oxytropis from locoweeds,experimental strain preserved in our lab was fermented about 30 d by Czapek’s fermentation; Collected mycelium and fermentation broth were analyzed by system pre-test; on this basis,petroleum ethe,chloroform,ethyl acetate and butanol phase of mycelium and broth were obtained by organic solvents gradient extraction,then TLC testing and GC testing were conducted.System pre-test concluded that fermentative culture contains alkaloids,proteins,phenols,tannins,flavonoids,quinones,volatile oil and grease.Fermentation system of Undifilum oxytropis contains at least 5 compounds by TLC testing.SW and its analogues indwell exist in butanol phase of mycelium and broth.GC testing drawed that the content of SW in fermentation broth of Undifilum oxytropis was 5.17×10-3g/L.SW and other useful secondary metabolites exist in mycelium and fermentation broth of Undifilum oxytropis.

Key words:Undifilum oxytropis; swainsonine; secondary metabolite; fungal endophyte; locoweed