2012年-2014年闽西地区PRRSV流行株ORF5基因遗传变异分析

黄春芳，刘建奎，龚丽珍，杨炳辉，曾建平，陈安妮，陈小燕

(福建省龙岩学院生命科学学院，福建省家畜疫病防治与生物技术重点实验室，福建省生猪疫病防控工程技术研究中心，福建龙岩 364000)



2012年-2014年闽西地区PRRSV流行株ORF5基因遗传变异分析

黄春芳，刘建奎*，龚丽珍，杨炳辉，曾建平，陈安妮，陈小燕

(福建省龙岩学院生命科学学院，福建省家畜疫病防治与生物技术重点实验室，福建省生猪疫病防控工程技术研究中心，福建龙岩 364000)

摘要：为了研究2012年-2014年闽西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的分子生物学特性和变异规律，对分离自闽西多个地区25份疑似PRRS病料的10个PRRSV分离株，应用RT-PCR对其中ORF5基因进行扩增及序列分析，从而了解闽西地区PRRSV的遗传变异性。结果表明，10个毒株均为美洲型PRRSV，9株PRRSV ORF5基因全长为603 bp(FJ05为600 bp)，10个毒株ORF5基因之间的核苷酸同源性为88.4%～99.3%；与VR-2332、MLV和CH-1a毒株的核苷酸同源性为88.3%～98.8%，与我国高致病性代表毒株JXA1、WUH1、HUN4等的同源性为88.9%～99.0%，与欧洲型毒株代表毒株LV的同源性为63.8%～65.0%。ORF5基因推导氨基酸序列变异主要发生在9-40位和58-62位，10株PRRSV ORF5氨基酸同源性为88.5%～99.5%；与VR-2332、MLV和CH-1a的氨基酸同源性为87.5%～98.5%，与我国高致病性代表毒株JXA1、WUH1、HUN4等的同源性为88.0%～ 99.5%，与欧洲型毒株代表毒株LV的同源性为56.6%～59.2%。遗传进化树表明，闽西地区PRRSV可以分为疫苗株(1株，10%)、中等毒力PRRSV(1株，10%)和HP-PRRSV(8株，80%)3个亚群，其中以HP-PRRSV为主，表明闽西地区PRRSV流行毒株呈现遗传变异多样性。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；ORF5基因； 反转录-聚合酶链反应；遗传变异

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV)引起的一种高度传染性疾病，该病于1987年在美国首次暴发,其特点是发病猪群具有繁殖障碍和呼吸道症状[1-3]。我国于1996年首次分离到PRRSV，从而证实了PRRS在中国存在。2006年在中国南方暴发的“猪高热病”，其主要病原就是PRRSV变异株(HP-PRRSV)，给中国造成严重的经济损失。目前，PRRS已成为危害全球养猪业的主要疫病之一，呈世界性分布[4]。

PRRSV为有囊膜的单股正链RNA病毒，大小约15 kb，有10个开放阅读框 (ORF1a、1b、2a、2b、3、4、5、5a、6和7) ，ORF1(ORF1a 和ORF1b)，约占病毒基因组的80%，编码PRRSV的非结构蛋白；ORF2～5、ORF5a和ORF6～ORF7基因编码PRRSV的结构蛋白GP2～GP5、ORF5a、M 及N[5-6]。研究表明，现有的疫苗尚不能完全有效地预防所有或大部分PRRSV流行毒株，这与病毒的高变异性、猪个体免疫反应的差异性等多方面因素有关。ORF5编码的是囊膜糖蛋白GP5，是PRRSV主要的免疫原性蛋白，是PRRSV的主要结构蛋白之一，也是PRRSV结构基因中变异最大的一个结构蛋白。GP5蛋白具有较好的免疫原性，激发细胞免疫和体液免疫[7-9]。因此，GP5蛋白在PRRSV的致病性、预防与控制等方面具有重要意义，针对其研究可为PRRS的防控提供理论基础。

研究表明，ORF5基因极易发生变异，不同国家和地区PRRSV的ORF5基因同源性差异较大。由于 PRRSV毒株间存在一定的抗原差异性，从而使PRRSV疫苗在不同型之间的保护力很不理想，这也是目前PRRSV疫苗研发的一个难点[10]。龙岩市位于福建省西部，是福建省生猪主要生产区，年出栏生猪数量占全省第一。由于近年来PRRS给闽西地区养猪业造成重大经济损失，因此本文研究闽西地区PRRSV ORF5基因克隆及序列分析，遗传变异特征和生物学特性，为今后该地区预防和控制PRRS提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1病料来源及细胞2012年-2014年在闽西地区新罗区、永定县、武平县和连城县等县(区)无菌采集25份疑似PRRSV感染的猪肺脏、脾脏、肾脏和淋巴结等组织样品。Marc-145细胞由龙岩学院生命科学学院预防兽医学重点实验室保存。

1.1.2主要试剂M-MuLV反转录酶、RNA酶抑制剂、TaqDNA聚合酶，宝生物工程(大连)有限公司产品；RNA抽提试剂盒、质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒，天根生化科技有限公司产品。

1.1.3PCR 引物参照文献[9]针对PRRSV ORF5两侧保守序列设计引物P1:5′-CTGAGACCATGAGG-TGGGCAACT-3′; P2 :5′-CATCACTGGCGTGTAGGTAATAGAAAAC-3′，扩增片段大小为750 bp。

1.2方法

1.2.1病毒分离鉴定将无菌采集的猪肺脏、肾脏、脾脏和淋巴结2 g～3 g以1∶5的比例加入无血清的DMEM研磨，反复冻融3次，8 000 r/min离心10 min，上清液用0.22 μm的滤膜过滤除菌，接种于已经长成单层的Marc-145细胞，37 ℃ 吸附1 h，弃去接种液，PBS洗3次，加入DMEM维持液，37 ℃ CO2培养箱中继续培养3 d～5 d，当细胞病变(CPE)出现80%左右时收毒，置-80 ℃保存备用。

1.2.2RT-PCR扩增利用RNA提取试剂盒提取病毒基因组RNA，按照Takara试剂盒说明书进行RT-PCR扩增。

应用M-MuLV反转录酶试剂盒说明书将提取的RNA反转录为cDNA。PRRSV ORF5扩增体系为25 μL：10×PCR buffer (Mg2+)2.5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 1 μL，上、下游引物 (20 mmol/L) 各0.5 μL，cDNA 2 μL，ExTaqDNA聚合酶0.25 μL，用灭菌去离子水补至25 μL。PCR反应程序：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 10 min。同时设阴性对照。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3目的基因的序列分析将回收纯化后的PCR产物连接到pMD19-T载体上进行转化。提取转化后的重组质粒进行双酶切鉴定，并将鉴定均为阳性的重组菌株送测序公司测序，测序结果采用Mega 6.0软件构建遗传进化树。

2　结果

2.1病毒的分离培养

将处理的病料接种于生长良好的Marc-145细胞，4 d～5 d出现典型的CPE，表现为细胞聚集成丛，变圆、脱落，共分离到10株PRRSV，病毒分离率为40%。

2.2PCR结果

10个PRRSV毒株经PT-PCR扩增后，通过凝胶电泳结果显示扩增片段约在750 bp处，与预期大小相符(图1)。

M.DNA标准DL 2 000; 1～10.FJ01～FJ10；11.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-10.FJ01-FJ10；11.Negative control

图1PRRSV ORF5基因片段的RT-PCR扩增结果

Fig.1PCR results of ORF5 gene of PRRSV by RT-PCR

2.3目的基因的序列测定与分析

2.3.1核苷酸的同源性分析将获得的10个PRRSV分离株的ORF5基因与国内外已发表的ORF5核苷酸序列进行比较，其中VR-2332为美洲型标准株，RespPRRS MLV为疫苗株，LV为欧洲型PRRSV，CH-1a、HB-1(sh)2002、HB-2(sh)2002、JXA1、WUH1、HUB1和HUN4等均为国内代表株。核苷酸序列比较结果见图2。结果表明，所分离的10个毒株ORF5基因之间的核苷酸同源性为88.4%～99.3%，与美洲标准株VR-2332和MLV的核苷酸碱基同源性为88.3%～98.8%，与中国经典毒株CH-1a的同源性为91.9%～94.7%，与我国高致病性代表毒株JXA1、WUH1、HUN4等的同源性为88.9%～99.0%，与欧洲型毒株代表毒株LV的同源性为63.8%～65.0%。

2.3.2氨基酸同源性分析9个PRRSV分离株的ORF5基因全长为603 bp，编码200个氨基酸，FJ05 ORF5基因全长为600 bp，编码199个氨基酸，将10个PRRSV分离株的ORF5基因推导的氨基酸序列与国内外已知的ORF5氨基酸序列进行比较，结果见图3。结果表明，10个毒株ORF5基因之间的氨基酸同源性为88.5%～99.5%，与美洲标准株VR-2332和MLV的氨基酸同源性为87.5%～98.5%，与中国经典毒株CH-1a的同源性为91%～93.0%，与我国高致病性代表毒株JXA1、WUH1、HUN4等的同源性为88.0%～99.5%，与欧洲型毒株代表毒株LV的同源性为56.6%～59.2%。

图3　10株分离毒株与国内外分离毒株ORF5推导氨基酸序列的同源性比较

2.4ORF5基因推导氨基酸的变异分析

用DNA Star软件对10个PRRSV毒株ORF5基因的推导氨基酸序列进行分析，结果见图4。结果表明，10个PRRSV分离株ORF5基因推导氨基酸序列的变异主要发生在9-40 位和58-62位，其他位点相对比较保守，仅有个别氨基酸替换。在GP5 N端30-51 aa有4个～6个N糖基化位点，分别位于30、33、34、35、41和51，在闽西地区分离的10个PRRSV毒株中30、33、41、51位N糖基化位点均未发生改变。Ostrowski M等[11]和Wang X等[12]研究表明，37SHF/LQLIYNL45是中和表位，9个分离毒株存在F/L39→I39的突变。R13、R151位点与病毒毒力密切相关,10株PRRSV中FJ01在R13的位点发生了变异从由R变成了G[13]。FJ03在R151位点发生了变异，与HB-1sh/2002发生了相同的变异由R变成了K，FJ01在R151位点也发生了变异，与RespPRRS MLV发生了相同的变异由R变成了G。疫苗株(MLV)的137 aa为A、野毒株137 aa[12]，表明FJ01可能为疫苗株，其余9株是野毒株。

2.5遗传进化树

为了进一步分析闽西地区流行毒株与其他毒株在遗传进化上的关系，将这10个PRRSV毒株与国外已发表的毒株VR-2332、RespPRRS MLV以及国内CH-1a、HB-1(sh)/2002、HB-2(sh)/2002、JXA1、WUH1、HUB1、HUN4和JXwn06等代表毒株构建遗传进化树，由图5可知，10个毒株与VR-2332为代表的美洲毒株群处于同一个大分支，亲缘关系较近，与LV为代表的欧洲型毒株亲缘关系较远，由此可知本研究的10个PRRSV均为美洲毒株。10个美洲毒株群分为3个亚群，以FJ-02为代表的8个分离株与HP-PRRSV代表毒株(JXA1、WuH1、HuN4等)位于同一大分支中，亲缘关系较近，表明这8株PRRSV为HP-PRRSV。FJ-01分离株与VR-2332、RespPRRS MLV的亲缘关系较近，处于同一亚群，可能为疫苗株。FJ-03与HB-1sh/2002位于一分支中，亲缘关系较近。

图4　ORF5基因推导的氨基酸序列变异分析

图5　PRRSV ORF5氨基酸序列的进化树

3　讨论

研究表明，在免疫压力和环境作用下，PRRSV ORF5基因极易发生变异，导致不同国家和地区PRRSV ORF5基因抗原差异较大。囊膜糖蛋白GP5由ORF5基因编码，是PRRSV的主要结构蛋白之一，在病毒感染动物机体方面具有非常重要的作用[13]。

本研究的10个PRRSV ORF5之间的核苷酸同源性为88.4%～99.3%，与美洲标准株VR-2332和MLV的核苷酸碱基同源性为88.3%～98.8%，与中国经典毒株CH-1a的同源性为91.9%～94.7%，与我国高致病性代表毒株JXA1、WUH1、HUN4等的同源性为88.9%～99.0%，与欧洲型毒株代表毒株LV的同源性为63.8～65.0%。10个毒株之间的氨基酸同源性为88.5%～99.5%，与美洲标准株VR-2332和MLV的氨基酸同源性为87.5%～98.5%，与中国经典毒株CH-1a的同源性为91%～93.0%，与我国高致病性代表毒株JXA1、WUH1、HUN4等的同源性为88.0%～99.5%，与欧洲型毒株代表毒株LV的同源性为56.6～59.2%。从中可知在闽西地区流行的是美洲型毒株。从氨基酸的同源性比较中还可以得出10个毒株中只有FJ01 1株与疫苗株(MLV)的同源性较高，且在遗传进化树中处于同一亚群，疫苗株(MLV)的137 aa为A、野毒株137 aa主要是S，在氨基酸变异中只有FJ01毒株的137 aa为A，表明FJ01可能为疫苗株，其余9株137 aa是S，表明其是野毒株。另外，从遗传进化树中可以看出毒株FJ03与HB-1sh/2002亲缘关系较近，处于同一分支，HB-1sh/2002毒力比中国经典毒株CH-1a高，但比以JXA1为代表的高致病性毒株的毒力弱[14-15]，推测FJ03可能是经典毒株向高致病性毒株进化的中等毒力毒株，其余8株PRRSV与JXA1为代表的高致病性毒株处于同一分支，表明闽西地区PRRSV以HP-PRRSV为主，因此猪场可以选择HP-PRRSV疫苗进行免疫，以减少经济损失。同时闽西地区PRRSV分离株的遗传关系存在交叉，但没有明显的地域特征，可能与带毒猪或种猪的流动传播有关，因此猪场在引进种猪时应采取严格的检疫及生物安全措施。

美洲型PRRSV GP5蛋白中存在一个中和抗原表位(37-45 aa)和2个非中和抗原表位(27-30 aa、180-197 aa)[10-11]。本研究中的10株PRRSV与JXA1、HUN4等HP-PRRSV的GP5蛋白相比，在这些中和抗原表位和非中和抗原表位均发生了点突变，这些氨基酸的突变可能会使PRRSV产生免疫逃避，从而导致免疫失败。在GP5 N端30-51 aa有4个～6个N糖基化位点，研究表明，GP5糖基化会影响中和抗体的产生[11]。通过对闽西地区PRRSV GP5蛋白氨基酸进行糖基化位点分析，结果表明闽西地区分离的10株PRRSV中存在4个～6个N糖基化糖基化位点，即N30、N33、N34、N35、N41和N51。这些糖基化位点位于中和抗原表位附近，糖基化位点遮盖中和抗原表位，从而导致机体无法及时产生中和抗体。另外，闽西地区PRRSV GP5存在N糖基化糖基化位点增多的现象，这可能会导致PRRSV毒力增强。研究表明，GP5蛋白与PRRSV的感染密切相关，PRRSV的感染能力及诱导中和抗体产生受糖基化修饰的影响，闽西地区PRRSV存在N糖基化糖基化位点增多的现象，这是否会导致PRRSV毒力增强需要进一步研究。

综上所述，闽西地区主要流行的是高致病性PRRSV(8/10)，同时也存在中等毒力毒株(1/10)与疫苗株(1/10)，这给猪场防控PRRS带来严峻挑战。由于PRRS疫苗的有效性在很大程度上取决于野毒株与疫苗株是否具有抗原交叉性，为有效地控制PRRS，应加强对该病的分子流行病学调查、监测及病原变异规律的研究工作，为我国研发更具针对性、安全、高效的疫苗提供科学依据。

参考文献:

[1]Neumann Eric J,Kliebenstein James B,Johnson Colin D,et al.Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome on swine production in the United States [J].J Am Vet Med Assoc,2005,227(3)： 385-392.

[2]代军,雷蕾,任志华.猪繁殖与呼吸综合征防控研究进展[J].动物医学进展,2014,35(4):97-101.

[3]Prieto C,Castro J M.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in the boar:a review [J].Theriogenology,2005,63：1-16.

[4]Tian K,Yu X,Zhao T,et al.Emergence of fatal PRRSV variants:unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark [J].PLoS One， 2007， 2(6):e526.

[5]Kappes M A,Faaberg K S.PRRSV structure,replication and recombination:Origin of phenotype and genotype diversity[J].Virology,2015,479-480:475-486.doi: 10.1016/j.virol.2015.02.012.

[6]Firth A E,Zevenhoven-Dobbe J C,Wills,N M,et al.Discovery of a small arterivirus gene that overlaps the GP5 coding sequence and is important for virus production [J].J Gen Virol,2011,92:1097-1106.

[7]Lee J A,Kwon B,Osorio F A,et al.Protective humoral immune response induced by an inactivated porcine reproductive and respiratory syndrome virus expressing the hypo-glycosylated glycoprotein 5 [J].Vaccine，2014,32(29):3617-3622.

[8]袁庄川,王鲁彦,梅匀安,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的克隆和原核表达 [J].动物医学进展,2013,34(12):17-21.

[9]Kim W I,Kim J J,Cha S H,et al.Significance of genetic variation of PRRSV ORF5 in virus neutralization and molecular determinants corresponding to cross neutralization among PRRS viruses [J].Vet Microbiol,2013,162(1):10-22.

[10]李亮亮,张雪梅,汤小龙,等.猪繁殖与呼吸综合征核酸疫苗研究进展 [J].动物医学进展,2014,35(3):87-91.

[11]Ostrowski M,Galeota J A,Jar A M,et al.Identification of neutralizing and nonneutralizing epitopes in the porcine reproductive and respiratory syndrome virus GPS ectodomain [J].J Virol,2002,76(9):4241-4250.

[12]Wang X,He K,Zhang W,et al.Genetic diversity and phylogenetic analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in East China [J].Infect Genet Evol,2014,24:193-201.

[13]曹宗喜,师志海,林哲敏,等.PRRSV的病毒蛋白研究进展 [J].广东农业科学,2013,16:134-137.

[14]Zhou L,Zhang J,Zeng J,et al.The 30-amino-acid deletion in the Nsp2 of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerging in China is not related to its virulence [J].J Virol,2009,83:5156-5167.

[15]Xie J X,Cui T T,Cui J,et al.Epidemiological and evolutionary characteristics of the PRRSV in Southern China from 2010 to 2013 [J].Microb Pathog,2014,75:7-15.

收稿日期：2015-12-09

基金项目：福建省大学生创新创业计划训练项目(201511312057)；省属高校科研课题 (JK2015049)；福建省自然科学基金项目(2016J01168)；福建省科技重大专项(2014NZ0002-3)

作者简介：黄春芳(1994-)，男，福建泉州人，学士，主要从事分子病原学研究。*通讯作者

中图分类号:S852.659.6；Q789

文献标识码:A

文章编号:1007-5038(2016)07-0007-06

Genetic Variation of ORF5 Gene of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Isolates from Western Fujian in 2012-2014

HUANG Chun-fang,LIU Jian-kui,GONG Li-zhen,YANG Bin-hui,ZENG Jian-ping,CHEN An-ni,CHEN Xiao-yan

(FujianProvincialKeyLaboratoryforthePreventionandControlofAnimalInfectiousDiseasesandBiotechnology,FujianEngineeringResearchCenterforSwineDiseaseControlandPrevention,CollegeofLifeSciences，LongyanUniversity,Longyan,Fujian,364000,China)

Abstract:The result showed that 10 PRRSV isolates belonged to the North American genotype, the lengths of the nine ORF5 sequences were 603 nucleotides (FJ05 is 600 nucleotides). Ten isolates displayed a nucleotide identity ranging from 88.4% to 99.3% among themselves, they shared 88.3%-98.8% homology with VR2332, MLV and CH-1a; 88.9%-99.0% with JXA1, WUH1 and HUN4, and they shared only 63.8-65.0% with LV. High variable occurred at positions of 9-40 aa and 58-62 aa of GP5. Amino acid sequence alignments revealed that 10 isolates shared 88.5%-99.5% among themselves, they shared 87.5%-98.5% homology with VR-2332, MLV and CH-1a, 88.0%-99.5% with JXA1, WUH1 and HUN4, however, they shared only 56.6-59.2% with LV. The phylogenetic tree analysis showed that 10 isolates are divided into three subgroups, 8 strains (8/10, 80%) belonged to subgroup Ⅰ, which are closely related to the JXA1 strain. The FJ01 strain (1/10, 10%) belonged to subgroup Ⅱ, which is closely related to the VR-2332, FJ03 strain (1/10, 10%) belong to subgroup Ⅲ, which is closely related to the HB-1sh/2002 (the intersubgenotype). These results showed that PRRSV have been shown to undergo remarkable genetic diversity.

Key words:Porcine reproductive and respiratory syndrome virus; ORF5 gene; RT-PCR; genetic variation