鸡传染性支气管炎病毒血凝抑制试验抗原的研制

庄金秋，梅建国，祖立闯，苗立中，沈志强，

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600；2.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 2566000；3.滨州贝尔凯瑞生物技术有限公司，山东滨州 256600)



鸡传染性支气管炎病毒血凝抑制试验抗原的研制

庄金秋1，3，梅建国1，3，祖立闯2，苗立中1，沈志强1，2

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600；2.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 2566000；3.滨州贝尔凯瑞生物技术有限公司，山东滨州 256600)

摘要：为应用血凝抑制(HI)试验检验鸡传染性支气管炎疫苗免疫效力(血清、卵黄抗体水平)，建立了鸡传染性支气管炎病毒HI试验抗原的制备方法。该方法是通过选取抗原谱最广的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41株，经SPF鸡胚增殖培养36 h后无菌收取鸡胚尿囊液，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，上清用聚乙二醇(PEG)20000浓缩100倍；兔源A型产气荚膜梭菌中国标准株(C57-1株)37 ℃增殖培养18 h，4℃、12 000 r/min离心10 min取上清，经PEG 20000透析袋浓缩5倍后通过0.20 μm滤膜过滤除菌，然后将IBV液和A型产气荚膜梭菌菌液(含α毒素)二者按一定比例混合后经37 ℃恒温振荡感作2 h，4 ℃经48 h后制成。经大量试验表明，制备的IBV HI试验抗原效价高、稳定性好，可替代进口抗原应用于鸡群IBV疫苗免疫后血清抗体及卵黄抗体的HI效价检测。

关键词：传染性支气管炎病毒；血凝抑制试验；A型产气荚膜梭菌

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由冠状病毒科冠状病毒属的鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病[1-2]。感染鸡主要表现为咳嗽、气管啰音、打喷嚏等症状[3-4]。雏鸡及育成鸡感染后生长发育受阻，并可导致较高死淘率；产蛋鸡感染导致产蛋量减少和蛋品质下降，患病鸡常因呼吸道、肾脏或消化道感染而死亡，对养鸡业造成巨大的危害[5-6]。

IBV表面没有血凝素(hemaggeutinin,HA)，对动物红细胞无自然血凝特性，但经特殊处理后能够获得血凝活性，并且这种血凝活性能被特异性IBV血清抑制。根据这一特性，国内学者建立了多种IBV血凝抑制(HI)试验抗原[即IBV血凝抗原(HA抗原)]的制备方法[7-13]，其处理IBV先后应用胰酶、Ⅰ型磷脂酶C(PLC1)、神经氨酸酶和A型产气荚膜梭菌培养液上清等[14-17]，其所建立的方法有的制备程序复杂、有的产品稳定性差、有的获得的病毒血凝活性低等，这些原因导致目前国内尚无商品化的IBV HI试验抗原，多数疫苗企业均购买荷兰GD公司进口抗原，成本较高。根据IBV经A型产气荚膜梭菌的α-毒素(即卵磷脂酶)处理后能够获得较好的凝集鸡红细胞的特性[18-21]，我们研制了一种成本低、效价高、特异性强、稳定性好的IBV HI试验抗原，经多次临床样品检测，表明其与进口抗原的检测结果具有非常好的一致性，可完全替代昂贵进口抗原用于鸡群IBV疫苗免疫后血清抗体及卵黄抗体水平的监测。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1主要仪器高速冷冻离心机，赛默飞世尔(中国)公司产品；透析袋，美国Axygen公司产品；PEG20000，德国默克公司产品；一次性96孔V型血凝版，海门康泰公司产品；0.20 μm微孔滤膜，德国赛多利斯公司产品。

1.1.2主要材料SPF鸡蛋为济南斯帕法斯公司生产；IBV-M41株毒种、兔源A型产气荚膜梭菌C57-1株冻干菌种及禽病PCR检测试剂盒均由山东绿都生物科技有限公司提供；厌气肉肝胃酶消化汤根据中华人民共和国兽用生物制品规程(2000年版)附录制备；对照抗原为荷兰GD公司产品；新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病、产蛋下降综合征、禽流感H9阳性血清均购自中国兽医药品监察所，阴性血清采自济南斯帕法斯公司的SPF鸡，28份待检血清为自制传染性支气管炎血清、新支流三联灭活疫苗免疫SPF鸡效力检验血清及SPF鸡蛋卵黄抗体；8.5 g/L生理盐水、380 g/L柠檬酸钠抗凝剂、HA缓冲液、0.01 mol/L pH 7.4 PBS和10 mL/L鸡红细胞均由山东省滨州畜牧兽医研究院生物制品研究室自制。

1.1.3缓冲液的配制HA缓冲液：将5.96 g HEPES、8.19 g NaCl、0.15 g CaCl2依次溶于1 000 mL超纯水中，用0.1 mol/L NaOH溶液将pH调至6.5，0.20 μm微孔滤器过滤分装后，置4 ℃保存备用。

1.2方法

1.2.1IBV HI试验抗原制备

1.2.1.1病毒增殖将IBV M41株种毒用无菌生理盐水稀释100倍，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1 mL，置37 ℃鸡胚孵化器孵化，30 h前照蛋1次，弃去死胚，收取30 h～36 h的活胚，气室向上直立，置2 ℃～8 ℃中冷却4 h～24 h。将冷却的鸡胚取出，无菌收集尿囊液置灭菌瓶中备用。取病毒液少量进行HA试验及PCR检测，确定收获的病毒是否有血凝性及新城疫病毒、流感病毒、产蛋下降综合征病毒等常见外源病毒污染。若结果阳性则废弃重新增毒。

1.2.1.2病毒浓缩剪取适当长度的透析袋煮沸处理10 min，将收集的新鲜尿囊液于4 ℃、12 000 r/min离心10 min，无菌条件下将离心后的病毒液上清加入透析袋中并将透析袋置于1 000 mL烧杯中，加入聚乙二醇20000适量包埋透析袋，将烧杯置2 ℃～8 ℃经12 h～24 h，期间更换2次～3次新的聚乙二醇20000，至病毒液被浓缩100倍左右。无菌收集病毒浓缩液置灭菌瓶中，现用或置-80 ℃保存备用。1.2.1.3A型产气荚膜梭菌培养与菌液处理将兔源A型产气荚膜梭菌C57-1株冻干菌种按3%的接种量接种于厌气肉肝胃酶消化汤中，置37℃温箱中静置培养18 h，4℃、12 000 r/min离心10 min后取上清，经聚乙二醇20000浓缩5倍后用0.20 μm滤膜过滤除菌，分装，现用或置-80 ℃保存备用。

1.2.1.4IBV HI试验抗原制备取适量保存的病毒浓缩液和A型产气荚膜梭菌5倍浓缩菌液，将二者分别按1∶0.2、1∶0.3、1∶0.5、1∶0.8、1∶1、1∶1.5、1∶2的比例混合后，37 ℃恒温振荡感作2 h，4 ℃ 48 h后测定血凝价，选取血凝价最高且大于1∶28的配比比例进行大量制备IBV HI试验抗原。

1.2.2血凝抑制试验

1.2.2.1HI试验抗原血凝价测定取96孔V型微量板1块，每孔加入25 μL HA缓冲液，第1排加制备的IBV HI抗原25 μL，并做2个～4个重复孔，然后将抗原进行2倍系列稀释，稀释后每孔再加入25 μL HA缓冲液，最后再加入10 mL/L鸡红细胞悬液25 μL，用微量振荡器混匀，2 ℃～8 ℃下静置40 min，判定结果。以使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数作为判定终点。

1.2.2.24单位HA抗原的配制根据测定的HI抗原 HA效价，用HA缓冲液配制4单位HA抗原。

1.2.2.3HI试验操作步骤取96孔V型微量反应板，每孔加入25 μL HA缓冲液。分别吸取25 μL待检血清，加至每块板的第1排各相应孔内，并在每块板上设标准阳性血清和阴性血清对照，然后进行2倍系列稀释。分别向各孔中加入含4 HA单位的抗原25 μL(除红细胞对照孔外)，2 ℃～8 ℃下静置30 min。每孔中加入10 mL/L鸡红细胞悬液25 μL，轻轻混匀，2 ℃～8℃下静置40 min。

1.2.2.4荷兰GD公司抗原血凝抑制试验方法操作步骤同上，唯一不同之处在于其过程中所用缓冲液为0.01 mol/L pH7.4 PBS而非HA缓冲液。

1.2.2.5结果判定将反应板倾斜45°，以完全抑制4HA单位抗原的血清最高稀释度作为HI抗体效价。当4 HA单位抗原完全凝集，鸡红细胞阴性对照完全不凝集，阳性对照血清IBV HI抗体效价与原效价相比误差不高于1个滴度，各阴性对照血清及卵黄抗体IBV HI抗体效价不高于4 log2时，试验方可成立。

2　结果

2.1IBV HA试验及RT-PCR检测结果

HA试验结果表明，收集的IBV M41株SPF鸡胚尿囊液无自然血凝特性，RT-PCR检测结果见图1。由图1可见收获的IBV鸡胚尿囊液扩增出了440 bp的目标片段(图1)。另外，该尿囊液经由山东绿都生物科技有限公司提供的禽病PCR试剂盒检测未扩增出具有血凝性的新城疫病毒、流感病毒、产蛋下降综合征病毒及无血凝性的传染性法氏囊病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒及禽呼肠病毒等外源病毒。

2.2IBV HI试验抗原制备

将IBV 100倍病毒浓缩液和A型产气荚膜梭菌5倍浓缩菌液按照不同比例混合处理后HA试验结果见表1。由表1可见当浓缩后的IBV液和A型产气荚膜梭菌菌液按照1∶1比例(V/V)混合后，所测得的血凝价高达1∶29，接近荷兰GD公司IB M41抗原血凝价(1∶210)，其他比例获得的血凝价都不高于1∶26，因此大量制备IBV HI试验抗原可选用二者1∶1的比例配制，即A型产气荚膜梭菌菌液含量为50%。

2.3IBV M41株HI试验抗原应用结果

应用制备的IBV M41株HI试验抗原进行HI试验结果见表2。试验中采用新鲜鸡红细胞，自制抗原血凝价为1∶29。由表中可见，自制抗原与GD公司抗原比较二者差异不显著，17份IBV阴性血清抗体都在4 log2以下，这与章振华等[11]报道一致，其为血清中的非特异性凝集素所致。待测IBV阳性血清HI抗体效价均大于5 log2。

M.DNA 标准DL 2 000； 1.IBV M41株毒种； 2.IBV M41株鸡胚尿囊液； 3.阴性对照鸡胚尿囊液

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Positive control of M41 IBV strain; 2.Egg embryo allantoic fluid of IBV M41 strain; 3.Negative control of allantoic fluid

图1IBV M41株尿囊液RT-PCR扩增结果

Fig.1RT-PCR amplification results of IBV M41 strain

in egg embryo allantoic fluid

3　讨论

聚乙二醇20000分子质量大，用于浓缩病毒比用分子质量小聚乙二醇(如聚乙二醇6000)所用的时间短，能较好的保护病毒纤突，使病毒获得较高的血凝活性。虽然超高速离心、等密度梯度离心、蔗糖梯度离心等多种方法的超速离心病毒能除去病毒液中的杂蛋白，得到较纯净的病毒，但高速离心过程中损失的病毒纤突较多，而使用聚乙二醇20000浓缩较少损失病毒纤突，可获得较高血凝活性的病毒[22-23]。浓缩后的抗原有人用甲醛灭活[24-26]，有人用56℃水浴灭活，有人用β-丙内酯灭活，但我们研究发现，病毒灭活后血凝价会降低2个梯度，因此，我们不建议对病毒进行灭活处理。

A型产气荚膜梭菌菌液经PEG浓缩处理保持了较高浓度的卵磷脂酶，利于病毒获得较高的血凝价。但我们发现菌液浓缩倍数不宜过高，过高后与100倍浓缩的病毒液混合后黏度太大，进行HI试验容易导致非特异性凝集，出现假阴性结果，而5倍浓缩比例适中，也便于计算菌液含量。

本研究自制的IBV抗原置2 ℃～8 ℃可保存6个月。如添加明胶、蔗糖保护剂冻干后在-20 ℃可保存3年～5年。抗原制备过程中病毒和菌液的浓缩比例非常关键。有人认为菌液无需浓缩处理，含量在15%～20%即可获得具有较好血凝价的IBV，但是在浓缩后的抗原中直接加入未浓缩菌液并未获得较好效果。在抗原制备过程中发现病毒和菌液混合后，菌液含量如低于20%或高于60%，获得的抗原血凝价会降低2个梯度。因此我们建议将IBV 100倍浓缩液和A型产气荚膜梭菌5倍浓缩菌液二者按1∶1比例混合制备HI试验抗原。利用这种方法制备的抗原血凝价为1∶29，虽然比从荷兰进口的IBV HI抗原血凝价低(1∶210)一个梯度，但是应用本研究制备的HI抗原进行时试验时读数清晰，结果易判，不会出现使用GD公司抗原时经常出现的半凝集现象。抗原冷藏条件下，效价能够保持较长时间的稳定，这样避免了每次试验时临时制备抗原、且使用前需要反复检测验证的难题，减少了HI试验的工作量。

表1　HA试验结果

表2　HI试验结果

本研究的创新之处在于：①抗原无需经过超速离心，而是使用安全环保的PEG浓缩，操作简单又较好的保持了病毒的血凝活性;②应用A型产气荚膜梭菌菌液而非购买高价磷酸酯酶C，降低了成本;③抗原液未经过灭活剂灭活，保持了较高的血凝价;④无需冷冻，活病毒蛋白在冷藏条件下即可保持较好的稳定性;⑤整个制备过程无需特殊仪器和复杂工艺，一般实验室均能实现。因此，本研究提供了一种成本低、效价高、制作简便、稳定性好的IBV HI试验抗原的制备方法，其检测结果与应用进口抗原的检测结果一致，可替代进口抗原应用于鸡群IBV疫苗免疫后血清抗体及卵黄抗体的HI效价检测。

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收稿日期：2016-01-14

基金项目：山东省重点研发计划项目(2015GSF121027)；滨州市科技发展计划项目(2015ZC0109)

作者简介：庄金秋(1978-)，女，山东潍坊人，副研究员，兽医硕士，主要从事细胞培养和动物用病毒疫苗研制。

中图分类号:S852.659.6；S858.31

文献标识码:A

文章编号:1007-5038(2016)07-0034-05

Development of HI Test Antigen of Avian Infectious Bronchitis Virus

ZHUANG Jin-qiu1,3,MEI Jian-guo1,3,ZU Li-chuang2,MIAO Li-zhong1,SHEN Zhi-qiang1,2

(1.ShandongBinzhouAnimalScience&VeterinaryMedicineAcademy,Binzhou,Shandong，256600,China;2.ShandongLvduBio-industryCompany,LTD.,Binzhou,Shandong，256600,China;3.BinzhouBio-carrierBiotechnologyCo.,Ltd.,Binzhou,Shandong，256600,China)

Abstract:In order to determine the serum antibody level of avian infectious bronchitis virus (IBV) in the inactivated vaccine,the preparation method of HI test antigen of IBV was established.The widest spectrum of IBV M41 strain was selected and proliferated in allantoic fluid of SPF chick embryos for 36 h,and then centrifuged in 4℃ and 12 000 r/min for 10 minutes,and last concentrated 100 fold by the polyethylene glycol (PEG) 20000 dialysis bag.Rabbit Clostridium perfringens type A standard Chinese strain (C57-1 strain) was first cultured for 18 h,then centrifuged supernatant in 4℃ and 12 000 r/min for 10 minutes,and then concentrated 5 fold by the PEG20000 dialysis bag,and last filtered by 0.20 μm membrane.The IBV HI antigen was made by mixing the IBV virus fluid and type A Clostridium perfringens liquid (containing alpha toxin) according to a certain proportion,then by the constant temperature of 37℃ for 2 h,and then in 4℃ for 48 h.It was showed that the prepared IBV HI test antigen had high titer and good stability,and could successfully replace imported antigen by using for the HI detection of serum antibody and egg yolk antibody in the sera of chickens immunized with IBV vaccine by a large number of experimental results.

Key words:Infectious bronchitis virus; HI test; Clostridium perfringens type A