T-SPOT.TB检测结核专业人员结核潜伏感染与结核菌素皮肤试验的对比研究

宋　韬，李莉娟，付洪义

(1.河北省胸科医院结核内科，河北 石家庄 050041；2.中国人民解放军白求恩国际和平医院干部一科，河北 石家庄 050082)



·论著·

T-SPOT.TB检测结核专业人员结核潜伏感染与结核菌素皮肤试验的对比研究

宋韬1，李莉娟2，付洪义1

(1.河北省胸科医院结核内科，河北 石家庄 050041；2.中国人民解放军白求恩国际和平医院干部一科，河北 石家庄 050082)

[摘要]目的探讨结核分枝杆菌感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)诊断结核专业人员潜伏结核感染(latent tuberculous infection，LTBI)的价值。方法选取85例结核内科医护人员(结核专业人员)为研究组，另选85例健康者为对照组，2组既往均无结核病史、无结核病症状，胸片正常，应用T-SPOT.TB对2组进行外周血结核菌特异γ干扰素( interferon γ，IFN-γ)水平检测，同时进行平行的结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test,TST)检测。结果2组T-SPOT.TB阳性率差异有统计学意义，而TST阳性率差异无统计学意义。2种方法阳性率比较，研究组和对照组差异均有统计学意义(P<0.05)。一致性检验结果显示T-SPOT.TB与TST一致性较差(Kappa=0.123)。结论①密切接触传染性结核病患者是感染结核分枝杆菌的危险因素，其成为LTBI者的概率较非密切接触人群明显增高；②T-SPOT.TB阳性结果与是否密切接触传染性结核病患者显著相关，而TST阳性结果与是否密切接触传染性结核病患者无明显相关，这可能与我国极高的卡介苗接种率有关；③T-SPOT.TB诊断LTBI特异度高于TST；④T-SPOT.TB与TST的相关性较低，它为诊断LTBI提供了新的更为准确的方法。

[关键词]潜伏性结核；结核菌素试验；诊断

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.07.008

潜伏结核感染(latent tuberculosis infection ,LTBI)是指宿主感染结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，Mtb)后尚未发病的一种状态[1]。我国第5次流行病学调查显示Mtb感染者中绝大部分为LTBI[2]。LTBI人群是罹患结核病的高危人群，一旦其机体免疫能力减弱，发展为活动性结核病的可能性极高[3]。由于职业暴露的缘故，结核专业工作人员极易感染Mtb而成为LTBI者。本研究在河北省胸科医院结核内科开展，分别采用结核分枝杆菌感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)和结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test,TST)检测85名医护人员结核分枝杆菌感染情况，并设立健康对照组，比较并分析二者的一致性，旨在探讨T-SPOT.TB诊断结核专业人员LTBI的价值。

1　资料与方法

1.1一般资料选取河北省胸科医院结核内科符合入组标准的85名医护人员为研究组，男性10例，女性75例；年龄19～61岁，平均(33.58±10.25)岁。从本院体检中心进行健康体检的人群中随机选取符合入组标准的85名设为对照组，男性46例，女性39例；年龄17～58岁，平均(33.98±10.57)岁。入组标准：①年龄≥16岁；②既往无结核病病史，无糖尿病及风湿免疫病史，无其他肺部疾病史，无艾滋病病毒感染，无妊娠，无严重肝肾衰竭病史，近3个月内未应用免疫抑制剂及增强剂；③目前无任何结核病的临床表现，如咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、胸闷、气短、午后低热、乏力、纳差、消瘦及夜间盗汗；④胸片正常；⑤签署知情同意书。

1.2主要试剂无血清培养基：RPMI 1640，PPA laboratory Gmbh，仅用于样本开始的处理，培养液使用结束后丢弃。AIM-VTM，Invitrogen公司，用于细胞孵育阶段。PBMCs分离液：LymphoprepTM，Ads-Shield PocAS.Oslo.Norway，用于分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuckear cells，PBMCs)。无水乙醇(分析纯)，上海彤晟化工科技有限公司。PBS缓冲液：1x D-PBS(catalogue number 14040-091)，美国GIBCOTM公司，用于溶解保护试剂。T-SPOT.TB试剂盒，Oxford Immunotec，Abingdon，UK，进行T-SPOT.TB的原材料包括：①微孔培养板，96(12×8)孔，由板条组成，外层披覆有无毒的小鼠抗人的干扰素γ(interferon γ ，INF-γ)单抗；②抗原A(0.8 mL/瓶)，其内含有ESAT-6抗原以及牛血清白蛋白和抑菌剂；③抗原B(0.8 mL/瓶)，其内含有CFP-10抗原以及牛血清白蛋白和抑菌剂；④植物血凝素(phytohaemagglutin,PHA)对照(0.8 mL/瓶)，其内含有用于监控细胞活性的PHA以及牛血清白蛋白和抑菌剂；⑤200倍浓缩的标记抗体(50 μL)，其内含有碱性磷酸酶标记的小鼠的抗人INF-γ单抗；⑥显色底物溶液(25 mL)，其内含有BCIP/NBTplus；⑦结核菌素纯蛋白衍生物，北京祥瑞制药有限公司。

1.3主要仪器二级生物安全柜，美国Thermo Scientific公司。流式细胞仪，美国BD公司，进行PBMCs记数。ELISPOT分析仪，德国ADI公司，进行斑点记数。37 ℃，90%湿度，5%CO2培养箱，美国Thermo Scientific公司。4 ℃冰箱BCD-257SL，青岛海尔公司。超大容量低温离心机，美国Thermo Scientific公司。台式振荡器Vortex-Geniez，上海易扩仪器有限公司。电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司。新型全自动恒温鼓风干燥箱，上海智城分析仪器制造有限公司。移液器，美国Thermo Scientific公司。肝素锂真空采血管(CPT，4 mL)，美国BD公司。流式标本检测管，美国BD公司。细胞计数板，美国HYCOR生物医学公司。

1.4实验方法

1.4.1T-SPOT.TB试验①收集标本：肝素锂真空采血管收集每位受试者2管4 mL外周静脉血，收集之后立刻颠倒5～10次，18～25 ℃存放。标本应尽早进行检测，不宜超过4 h。②PBMCs分离：将4 mL血液与4 mL预热到37 ℃的RPMI 1640培养液等体积混匀；再加入4 mL预热的Lymphoprep分离液混匀，1 800 g，18 ℃，离心处理约30 min；用吸管吸起呈牛奶色、云雾状的PBMCs层，转移至15 mL尖底离心管中，加入AIM-V培养液至10 mL； 600 g，离心7 min，弃去上清液；再加入1 mLAIM-V培养液使其重悬沉淀；加入AIM-V培养液至10 mL， 350 g，离心7 min；弃去上清液，将沉淀悬浮于0.7 mLAIM-V培养液中。③细胞记数和稀释：记数活细胞后，调整细胞浓度在2.0～3.0×109/L；配制标准溶液500 μL，使其浓度达到25万个细胞/100 μL。④培养板组装和孵育：将培养板条嵌入培养板架内，逐渐使其恢复至室温；分别加入50 μL培养基(阴性控制)、阳性控制、结核分枝杆菌特异抗原A和B于对应的检测孔；每个样本使用4个检测孔供使用，每孔加入配制好的100 μL细胞标准溶液，于37 ℃，90%湿度2，5%CO2培养箱中孵育18 h。⑤斑点形成与记数：将培养板从培养箱端出，弃去细胞培养液；再在各个孔中加入PBS缓冲液200 μL，弃去PBS缓冲液，用吸水纸将残留于反应孔中的液体拍干；反复用新鲜PBS缓冲液将培养板洗涤4次；用PBS缓冲液200倍稀释浓缩标记抗体试剂；将工作酶复合物溶液50 μL置于各个孔中，6 ℃孵育1 h；再次用200 μL PBS缓冲液洗板4次；加入50 μL BCIP/NBT底物溶液至各个检测孔中，室温孵育7 min；蒸馏水彻底洗涤培养板，终止反应；37 ℃温箱干燥培养板；干燥后各个反应孔内有清晰可见的深蓝色的斑点，将其记数。⑥质量控制：对于一般的正常结果来说，空白对照孔应该是无或有很少的斑点，而放置有植物血凝素PHA对照孔内的斑点数应该≥20个；当空白对照孔内的斑点数≥10个时，为“不确定”结果。还有一种检测结果被认为是“不确定”结果，即当放置有细胞活性PHA对照孔内的斑点数≥20个或反应孔内遍布斑点(斑点数量太多)，而放置有PHA对照孔内的斑点数应该<20个时。对此情况的解释是绝大多数人群的T细胞对PHA有反应。除非能把抗原A孔或抗原B孔中的斑点数作依据结果解释和判断标准确定为有“反应性”，才能说明结果有效。基于生物科学和反应体系的原因，当空白的对照孔内的斑点数≤5个，并且抗原A孔内斑点数减去空白对照孔斑点数或抗原B孔内斑点数减去空白对照孔斑点数的结果在5～7之间时，也被认定为“不确定”结果。此时应当根据受试者所有相关的临床资料进行判断，如有必要，可再次进行复查。虽然ESAT-6和CFP 10抗原的特异性很高，在所有牛性分枝杆菌(包括卡介苗)以及绝大部分非结核分枝杆菌都不存在，但当受试者感染海分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、转黄分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、胃分枝杆菌时，T-SPOT.TB检测有可能出现“假阳性”结果。若怀疑受试者为上述细菌感染时，需要进行相关的鉴别诊断。结果判定，目视法判定标准：①阳性对照孔内斑点数≥20个视为试验有效；②阴性对照孔内斑点数为≤5个，A孔内斑点数或B孔内斑点数-阴性孔斑点数≥6个，认定结果为阳性；③若阴性对照孔内斑点数≥6个，A孔内斑点数或B孔内斑点数≥阴性孔斑内点数×2，认定结果为阳性；④若A孔内斑点数或B孔内斑点数的数量<20，且阳性对照孔内斑点数≥20个，认定结果为阴性。

1.4.2TST由在结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative tuberculin，PPD)试验室工作5年以上的专业护士进行操作，用PPD 5 U，在研究对象左前臂屈侧做皮内注射，72 h后观察结果。结果判定：在室内自然光线下，用食指和中指轻摸肿硬程度，然后用米度尺测量硬结的平均直径(纵径和横径相加再除以2)，测量时以垂直的最大纵径和最大横径为标准。①阴性：无反应或轻微红润，硬结平均直径在5 mm以下；②一般阳性：硬结平均直径在5～19 mm，且无水泡、坏死及淋巴管炎；③强阳性：硬结平均直径≥20 mm或不论硬结平均直径大小，出现水泡、坏死及淋巴管炎[4]。

1.5统计学方法应用SPSS 18.0软件进行统计学处理。计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。T-SPOT.TB与TST的一致性分析应用Kappa检验测量评估，Kappa值≥0.75，二者一致性较好；Kappa值<0.4，二者一致性较差。

2　结　　果

2组T-SPOT.TB阳性率差异有统计学意义(P<0.05)，而TST差异无统计学意义。2种方法阳性率比较，研究组和对照组差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

一致性检验结果显示T-SPOT.TB与TST一致性较差(Kappa=0.123)。

表1　2组T-SPOT.TB与TST阳性率比较Table 1　The positive rates of T-SPOT.TB group and TST group　(n=85，例数，%)

3　讨　　论

结核病是慢性呼吸道传染病，它严重危害着人体的健康和公共卫生安全，是全世界都在努力遏制和重点防控的传染病之一，而结核病感染控制是全球结核病控制的一项难题。据世界卫生组织调查全球约20亿人感染Mtb，绝大部分为LTBI[5]。LTBI是机体感染Mtb未被清除但不表现出任何临床症状的一种特殊状态，当机体免疫功能下降的时候，休眠的Mtb被唤醒、繁殖，从而发展成为活动性肺结核病[6]。可见LTBI不是简单的细菌暂停生长状态，而是与宿主免疫系统的动态平衡[7]。因此，如何快速而准确地诊断LTBI，如何采取有效的检测方法及早发现LTBI者，并加以早期干预，减少其发展为结核病患者的概率，是结核病防控的关键，对结核病的防控意义重大。目前我国尚无诊断LTBI的标准，临床上仅以TST阳性而无活动性结核病的临床表现和影像学改变为判断依据[8]。由于TST应用的PPD是数百种抗原的混合物，与卡介苗及多种非结核分枝杆菌有交叉性抗原，在我国这样一个卡介苗高接种率的国家，存在很高的假阳性[9]。自2010年以来T-SPOT.TB在我国飞速发展，文献显示其对结核菌的特异度及敏感度均达到80%以上[10]，尤其对诊断LTBI特异度更高，大有取代TST之势。本研究对此进行了初步的探讨。

本研究结果显示结核科医护人员T-SPOT.TB阳性率为43.5%，提示LTBI明显高于健康人群的4.7%，可见密切接触传染性结核病患者是感染Mtb的危险因素。结核科是结核病患者尤其是高传染性肺结核患者高度集中、频繁活动的场所，极易造成病患与医护人员之间的感染传播，有资料显示我国医务人员结核分枝杆菌感染率在50%～70%之间，年均患病率在415/10万～2240/10万之间[11]。鉴于目前的国情，我国大部分结核防治机构硬件设施不完善，这增大了结核科医护人员感染Mtb的风险。张忠顺等[12]利用T-SPOT.TB检测结核病防治专业人员Mtb潜伏感染情况，结果显示我国基层医务工作者尤其是结核病防治专业人员受Mtb潜伏感染的危险性高，且与接触时间成正比。医务人员被感染结核菌，一旦发病后果较严重，因为医务人员经常与结核病人接触，感染的Mtb不仅仅敏感菌，还有一部分是耐药菌，尤其是耐多药结核菌或是广泛耐药结核菌，对自身健康损害极大。我国分别于2010年和2012年发布了《中国结核感染预防控制手册》和《中国结核感染控制标准操作程序》，开展对医务人员Mtb感染控制宣教，加大感染控制经费投入等，但现有数据表明我国大部分地区目前未能开展规范化培训和Mtb感染控制[13]。因此，国家制定并及时补充有效的防范政策及措施，各个医疗机构(尤其是结核病专业防治机构)切实的贯彻和执行，每个人防范意识的提高是保护我们不成为LTBI者的坚实之盾。

本研究结核科医护人员TST阳性率与健康人群组无明显差异。这可以归因于我国从上世纪50年代就对新出生的婴儿常规接种卡介苗，而TST所应用的PPD成分不单一，是200多个抗原的粗提纯物，它与卡介苗及多种非结核分枝杆菌共享多个抗原表位，使TST特异度有限，故TST会导致一定数量的“假阳性”结果。

本研究中T-SPOT.TB显示结核科医护人员LTBI阳性率明显低于TST，而T-SPOT.TB显示健康人群LTBI阳性率明显低于TST。可见T-SPOT.TB诊断LTBI较TST有更高的特异度。这得益于ESAT-6和CFP-10作为抗原，二者编码来源于结核分枝杆菌基因中的一个菌种特异性基因片段。这个基因片段不存在于大部分的非结核分枝杆菌以及所有的牛型分枝杆菌(包括卡介苗)中[14]。研究显示，T-SPOT.TB在诊断Mtb感染方面比TST有更高的特异度，WHO也强烈推荐T-SPOT.TB在部分资源条件许可的高收入和中高收入国家用于检测LTBI[15]。

本研究一致性分析结果显示T-SPOT.TB与TST的一致性较差，这可以归因于T-SPOT.TB诊断准确性的提高和由于我国广泛接种卡介苗而导致的TST诊断准确性下降。

综上所述，密切接触传染性结核病患者是感染Mtb的危险因素，其成为LTBI者的概率较非密切接触人群明显增高；T-SPOT.TB阳性结果与是否密切接触传染性结核病患者显著相关，而TST阳性结果与是否密切接触传染性结核病患者无明显相关，这可能与我国极高的卡介苗接种率有关；T-SPOT.TB诊断LTBI的特异度高于TST；T-SPOT.TB与TST的相关性较低，它为诊断LTBI提供了新的更为准确的方法。

本研究的不足之处：结核专业组与健康人群组性别不匹配，结核病专业人员以女性居多，但T-SPOT.TB与性别分布关联较小，故未做校正；由于实际条件所限，研究样本量较小，且不同的医院、不同的科室由于管理方法的不同，Mtb的感染率亦会不同，故更具说服力的调查应在多家不同的医院进行，并进一步扩大样本量，以求得出更完善的结论。

[参考文献]

[1]中华医学会结核病分会,《中华结核和呼吸杂志》编辑委员会.γ-干扰素释放试验在中国应用的建议[J].中华结核和呼吸杂志,2014,37(10):744-747.

[2]全国结核病流行病学抽样调查技术指导组,全国结核病流行病学抽样调查办公室.2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告[J].中国防痨杂志,2012,34(8):485-508.

[3]吴雪琼,梁艳,王国志.γ-干扰素释放试验临床应用的价值、问题与展望[J].中国防痨杂志,2015,37(7):722-727.

[4]唐神结,高文.临床结核病学[M].北京:人民卫生出版社，2011:80-81.

[5]Zumla A,George A,Sharma V,et al. WHO′s 2013 global report on tuberculosis:successes,threats,and opportunities[J]. Lancet,2013,382(9907):1765-1767.

[6]Kondratieva T,Azhikina T,Nikonenko B,et al. Latent tuberculosis infection:what we know about its genetic control?[J]. Tuberculosis(Edinb),2014,94(5):46246-46248.

[7]吉萍,范小勇,吴康,等.结核分枝杆菌潜伏感染相关抗原的研究进展[J].中华微生物学和免疫学杂志,2015,35(1):59-64.

[8]陈友鹏,黄思敏.潜伏结核感染的研究新进展[J].新医学,2008,39(12):820-821.

[9]史玲莉.免疫学方法诊断结核病的研究进展[J].河北医科大学学报，2013,34(11):1475-1480.

[10]Dai Y,Feng Y,Xu R,et al. Evaluation of interferon-gammarelease assays for the diagnosis of tuberculosis：an updated metaanalysis[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2012,31(11):3127-3137.

[11]耿梦杰,宋渝丹,赵飞,等.国内外医务人员结核感染控制现状的比较研究[J].中国防痨杂志,2013,35(8):581-586.

[12]张忠顺,楼海,肖和平.结核病专业人员及密切接触者结核潜伏感染的研究[J].中国防痨杂志,2011,32(1):36-40.

[13]潘丽萍,贾红彦,张宗德. 医务人员结核分枝杆菌潜伏感染的相关问题[J].中华结核和呼吸杂志,2016,39(1):16-20.

[14]Drobniewski F,Cobelens F,Zellweger JP,et al. Use of Gamma-interferon assays in low-and medium-prevalence countries in Europe: a consensus statement of a Wolfheze Workshop organised by KNCV/EuroTB,Vilnius Sept 2006[J]. Euro Surveill,2007,12(7):E070726.2.

[15]方勇,肖和平. 潜伏性结核感染的诊治进展[J].中国防痨杂志,2016,38(2):36-40.

(本文编辑：刘斯静)

[收稿日期]2015-10-21；[修回日期]2015-11-15

[基金项目]河北省医学科学研究重点课题(1020140373)

[作者简介]宋韬(1980-)，男，河北石家庄人，河北省胸科医院主治医师，医学硕士，从事结核疾病诊治研究。

[中图分类号]R52

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2016)07-0772-05

A comparative study of applying T-SPOT.TB and TST in the diagnosis of LTBI in TB professionals

SONG Tao1, LI Li-juan2, FU Hong-yi1

(1.Department of TB Medicine， Hebei Chest Hospital， Shijiazhuang 050041， China；2.First Department of Cadre's Ward, Bethune International PeaceHospital of Chinese PLA， Shijiazhuang 050082， China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the value of T-SPOT.TB in the diagnosis of latent tuberculous infection (LTBI) in TB professionals. MethodsEight-five cases of TB medical staff as TB professionals were selected. Eight-five cases of healthy people were selected for control group, all without previous TB history or symptoms and with normal chest film. Apply T-SPOT.TB was detected by the specific interferon γ (IFN-γ)level of the peripheral blood. Tuberculin skin test(TST) was used also. TB bacillus while carrying out parallel TST tests. ResultsT-SPOT.TB results show that the difference between the study group and the control group was statistically significant. TST indicates that there is no statistic difference between the 2 groups. The positive rate comparison of the two methods shows that there is statistic difference between the 2 groups(P<0.05). Consistency check indicates that there is poor consistency between the two test methods (Kappa=0.123). Conclusion①Closely contacting with TB infected patients is a risk factor which leads to MTB infection. People with close contact have a higher rate of becoming LTBI patients than those without close contact. ②T-SPOT.TB positive results are positively correlated with those who closely contact with TB infected patients, while TST positive results are not correlated, probably due to a very high BCG vaccination rate in China. ③T-SPOT.TB has a higher specificity than TST in LTBI diagnosis. ④T-SPOT.TB has a low correlation with TST and serves as a more accurate method of LTBI diagnosis.

[Key words]latent tuberculosis； tuberculin test； diagnosis