早胜牛及其杂交类群IGF-II基因分子遗传特性分析

容维中，张艳丽(执笔)，王　珂

(1.甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃 平凉744000；2.平凉市农产品质量安全检测检验中心)



早胜牛及其杂交类群IGF-II基因分子遗传特性分析

容维中1，张艳丽2(执笔)，王珂1

(1.甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃 平凉744000；2.平凉市农产品质量安全检测检验中心)

采用PCR-SSCP检测和DNA测序技术，分析了早胜牛及其杂交类群IGF-II基因第2外显子的遗传多态性。结果表明，第2外显子检测到1处SNPs(T116C)，产生了 2 种等位基因(E、F)和 3 种基因型(EE、EF、FF)，其中，E为优势等位基因，EF型为优势等位基因型；群体多态信息含量为0.42，处于中度多态，表明该位点遗传变异程度较高，人工选择潜力较大，这为后期开展IGF-II基因多态性与其肉用性状的相关性分析提供了一定的理论基础。

早胜牛；IGF-II基因；PCR-SSCP；肉用性状；选育

陇东地区位于甘肃省东部，属于典型的黄土高原沟壑山区，境内气候适宜，农作物秸秆资源丰富，自古就有养牛的传统和习惯。通过多年人工驯化和杂交选育而成的优良地方类群—早胜牛，于1986年被列入《甘肃省畜禽品种志》，被广泛应用于全省黄牛杂交改良实践中，带动了当地肉牛产业的发展。但长期以来在选育方向和产业定位等方面，与其它各地一样都存在盲目引种开展杂交改良，而忽视对地方黄牛脂肪沉积好、肉质细嫩等特性的挖掘和利用。

应用分子标记技术在保留地方良种特性的基础上，选育肉牛新品种已成为现代育种手段之一。IGF-II基因(促胰岛素生长因子2)属于胰岛素生长因子家族， 与胰岛素具有高度的同源性， 对胚胎发育、骨骼生长、脂肪沉积等方面具有重要的调节作用。基于此，本研究采用PCR-SSCP检测和DNA测序技术，对IGF-II基因序列特征及遗传特性进行了分析，旨在为确定可用于肉用性状选育的优势基因型和开展早胜牛肉用新品种早期选育提供分子水平上的理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物的选择与血样的采集在庆阳市宁县兴旺牧业有限责任公司选择30头体质健康、年龄相近的早胜牛及其杂交类群(南德温×早胜牛杂交一代、安格斯×早胜牛杂交一代)，采用静脉采血法，每头牛采集血样7 mL。

1.1.2引物设计与合成参照已发表在Genebank上的IGF-II基因核苷酸序列(登录号：DQ298739)，采用Prime 5.0 软件设计引物，由北京三博远志生物技术有限责任公司进行合成。引物信息：上游5′-CCTCAGCCTCATCCCCTCCTTTGC-3′，下游5′-CTGTGCTCTATTTGCTGTGTTGTCT-3′，扩增区域为IGF-II基因第2外显子，扩增长度为217 bp。

1.2方法

1.2.1PCR扩增对检测合格的DNA产物进行PCR扩增，反应体系为：总体积50 μL，其中2×Taq Master Mix 混合液25 μL，上下游引物(10 pmol/uL)各2 μL，DNA模板(100 ng/μL)2 μL，ddH2O 19 μL。反应条件为:：94℃预变性5 min，34个循环(94℃变性5 min，63℃退火30sec，72℃延伸30 sec)，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR 产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

1.2.2SSCP检测与测序取2 μL PCR产物与6 μl变性缓冲液(98%甲酰胺、10 mmol/L EDTA、0.025%溴酚兰、0.025%二甲苯青)混匀，98℃变性10 min后置于冰水浴上5 min，然后上样于非变性聚丙烯酰胺凝胶(浓度为12%、交联度为29∶1)，在4℃、220 v的条件下预电泳20 min，然后将电泳槽接通电源后放在冰箱中(4℃、140 v)恒温恒压电泳12～18 h。电泳结束后，用优化后的银染法(染色和显色两步)进行染色和判型，将不同基因型个体送至北京三博远志生物技术有限公司进行纯化和测序。

1.2.3数据处理利用PopGen 32软件计算基因型频率、等位基因频率、有效等位基因数(Ne)、纯合度(Ho)和杂合度(He)，利用PIC CALC V0.6软件计算多态性信息含量(PIC)。

2　结果

2.1基因组DNA提取

由图1可见，采用D3471型血液DNA提取试剂盒提取的DNA条带清晰，无拖尾现象，经分光光度计检测，OD260/OD280值为1.7，纯度较好，可用于PCR反应。

图1　血液基因组 DNA 凝胶电泳图

2.2PCR-SSCP

从图2可以看出，PCR扩增产物条带清晰，无非特异性片段，且片段长度与目的条带大小一致。经PCR-SSCP检测和测序，IGF-II基因Exon2位点在116 bp处发生了T/C的单碱基突变，产生了EE、FF和EF 3种基因型，如图3和图4所示。

图2　PCR 扩增结果　　　　　　　　　图3　PCR-SSCP检测结果

图4　不同基因型测序结果

2.3遗传指标分析

表1显示，IGF-II基因Exon2位点，早胜牛及其杂交类群中E为优势等位基因，EF型为优势等位基因型。该群体纯合度为0.69，多态信息含量为0.42，属于中度多态，表明Exon2位点，早胜牛及其杂交类群遗传变异较大。

表1　IGF-II基因Exon2位点遗传指标分析

3　分析与讨论

IGFs家族是一类具有多种生理功能的因子，含IGF-I和IGF-II 两种类型，对多数组织和细胞的生长、分化、繁殖起维持和调节的作用，是影响畜禽经济性状表达的主效基因之一。关于IGF-I基因多态性的研究主要集中在生长发育性状方面，暮松智报道，凉山半细毛羊IGF-1基因不同基因型对初生重、断奶重和断奶日增重有显著影响(P<0.05)。潘和平等研究发现，IGF-1基因内含子1多态性对大通牦牛6月龄、12月龄、18月龄体重及体斜长有显著影响(P<0.05)。近几年，关于IGF-II基因的研究较为活跃，对猪、牛、羊、鹅等畜禽IGF-II基因多态性与其生长发育、胴体性状的关联性方面已有相关报道，许多研究结果表明IGF-II基因可能是影响畜禽胴体性状及肉质的重要候选基因。

早胜牛作为甘肃省优良地方类群，通过多年选育提高，具有生产以脂肪沉积为特点的优质牛肉的潜质和培育肉牛新品种的可能，研究影响早胜牛肉用性状的主效基因对其遗传资源保护和种质创新具有重要意义。本研究采用PCR-SSCP检测和DNA测序技术，分析了早胜牛及其杂交类群IGF-II基因外显子2的序列特征及遗传特性，检测发现在第2外显子116 bp处发生了T→C的单碱基突变，由此产生了E、F 2个等位基因和EE、EF、FF 3种基因型，这与韩瑞华、张争锋分别在秦川牛和南阳牛上的检测结果类似，另据报道，IGF-II基因在第4外显子、第7内含子及第8内含子上也存在多态性，还有待于进一步验证，但上述研究报道都表明IGF-II基因具有丰富的多态性。多态信息含量与群体杂合度一般作为反映群体遗传多样性的指标，其数值的大小表明群体遗传变异水平的高低。本研究发现，IGF-II基因第2外显子，群体杂合度为0.31，多态信息含量为0.42，属于中度多态，表明该位点早胜牛及其杂交类群遗传变异程度较高，人工选择潜力较大，适合作为分子候选标记位点。

本研究结果进一步明确了IGF-II基因第2外显子的分子遗传特性，揭示了该位点多态性丰富，这为后期开展IGF-II基因多态性与早胜牛肉用性状的相关性分析，筛选确定可用于肉用性状选育的优势基因型，加快肉用新品种选育提供了理论基础。

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Analysis of the Molecular Genetic Characteristics of IGF-II Gene in Zaosheng Cattle and its Hybrid Groups

RONG Wei-zhong1, ZHANG Yan-li2, WANG Ke1

(1.AnimalHusbandryandVeterinaryResearchInstitute,PingliangGansu744000China;2.ExamineandInspectionCenterforAgriculturalProductsSafetyandQualityinPingliangCity)

PCR-SSCP examine and DNA sequencing technologies were conducted to detect single nucleotide polymorphism of IGF-II gene with exon 2 in Zaosheng cattle and its hybrid groups. The results showed that there were one SNPs (T116C), two alleles and three genotypes (EE、EF、FF), and allele E and Genotype EF were respectively identified as the dominant allele and genotypes. Zaosheng cattle and hybrid groups achieved moderate polymorphisms with PIC of 0.42, and IGF-II gene with exon 2 displayed a higher genetic variability and larger artificial selection potential. Therefore, this study could provide certain theoretical basis with association analysis of genetic polymorphism in IGF-II gene and beef performance traits.

Zaosheng cattle; IGF-II gene; PCR-SSCP; beef performance traits; breeding

1004-6704(2016)04-0024-03

2016-04-15

甘肃省技术研究与开发专项计划(1207TCYL016)。

容维中(1965-)，男，甘肃平凉人，本科，副研究员，研究方向为动物营养及牛羊繁殖技术。

S 813.3

A