基于PCR-DGGE方法分析榨菜中乳酸菌群落结构

燕平梅，乔宏萍，赵文婧，单树花，王 琪，柴 政，陈燕飞（.太原师范学院生物系，山西 太原 03069；.山西大学生命科学学院，山西 太原 03003）



基于PCR-DGGE方法分析榨菜中乳酸菌群落结构

燕平梅1，乔宏萍1，赵文婧1，单树花1，王 琪2，柴 政1，陈燕飞1
（1.太原师范学院生物系，山西 太原 030619；2.山西大学生命科学学院，山西 太原 030031）

摘 要：为了深入了解榨菜中的乳酸菌多样性以及影响因素，以市场销售含有辣椒和不含辣椒两种袋装榨菜为研究对象，测定榨菜中的食盐浓度以及亚硝酸盐含量；通过变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）法分离榨菜总微生物混合16S rDNA基因V7～V8片段，采用Quantity One软件分析乳酸菌物种丰富度、均匀度及物种多样性指数。结果表明：含辣椒的榨菜食盐浓度和亚硝酸盐含量均略低于不含有辣椒的榨菜；含有辣椒和不含辣椒的榨菜两者间物种多样性指数、丰富度和均匀度无显著差异（P＞0.05）。通过回收DGGE电泳带，经克隆后测定碱基序列、与GenBank库序列对比鉴定，不含有辣椒的榨菜5 条回收聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）-DGGE泳带a、b、c、d、e经鉴定分别与Pediococcus argentinicus CRL 776、Uncultured Lactobacillus sp.isolate DGGE gel band lx12、Uncultured bacterium clone 11.02-12、Uncultured bacterium clone 11.02-9、Uncultured Lactobacillus sp.clone PxSC03相似度为98%、96%、97%、97%、97%。含有辣椒的榨菜4 条回收PCR-DGGE泳带1、2、3、4经鉴定分别与Uncultured Lactobacillus sp.、 Lactobacillus sakei A156、Lactobacillus sakei YY1、Lactobacillus sakei WJ1相似度为96%、97%、98%、97%。研究结果表明辣椒对榨菜中微生物群落结构无显著影响。

关键词：榨菜；亚硝酸盐；乳酸菌；聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳

引文格式：

燕平梅， 乔宏萍， 赵文婧， 等.基于PCR-DGGE方法分析榨菜中乳酸菌群落结构［J］.食品科学， 2016， 37（13）: 136-139.

YAN Pingmei， QIAO Hongping， ZHAO Wenjing， et al.PCR-DGGE analysis of lactic acid bacterial community structure in pickled mustard tuber［J］.Food Science， 2016， 37（13）: 136-139.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613024. http://www.spkx.net.cn

榨菜作为深受大众喜爱的腌菜之一［1-3］，口感独特、味道鲜美、食用方便，是中国人日常饮食中不可缺少的配菜。随着现代食品生物技术的发展，研究发酵榨菜中的微生物已成为改善榨菜口感和风味的一种有效途径。

目前针对发酵蔬菜中微生物多样性的研究大多使用培养技术，受培养条件的限制，该方法并不能完全揭示产品中微生物菌群的组成。之前有研究表明，自然界中只有不到1%的微生物可培养［4］，这表明以纯培养的方式研究发酵蔬菜中微生物的组成，结果可能会低估产品中微生物的多样性。伴随分子生物学的发展，越来越多基于非培养的微生物检测方法和技术如变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）/温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）技术［1，5］、克隆文库分析法［6-7］、单链构象多态性（single stronded conformation poly morphism，SSCP）技术［2，8］和高通量测序技术［9］等被广泛应用于发酵蔬菜微生物检测中。这些新技术的使用使自然界中99%以上不可培养微生物的研究成为可能。其中以聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）为基础的方法，如DGGE是从遗传角度通过PCR对提取出的生物DNA进行扩增，之后可以通过DGGE将长度相同但是碱基序列不同的DNA分离，从而达到研究微生物多样性、亲缘关系鉴定、基因突变检测等目的。PCR-DGGE方法已被用于传统发酵食品中微生物群落结构的研究［5，10］、泡菜乳酸菌多样性的研究［11］、发酵白菜卤中乳酸菌的多样性分析［12］等。

随着对榨菜的研究越来越深入，杨王君等［13］通过微生物的培养分离方法对四川榨菜进行研究，分析了榨菜发酵后熟期间微生物的种类；李正国等［1］将传统分离培养方法和DGGE法相结合来检测榨菜腌制过程的细菌多样性，得到了7 个属的细菌群落，并且得出优势菌群是乳杆菌属的结论；为了进一步了解榨菜的微生物多样性，本实验以袋装榨菜为材料，通过PCR-DGGE方法对榨菜进行研究，探讨袋装榨菜的微生物群落结构及其优势种群。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

榨菜产自杭州富阳千禧笋厂，购于沃尔玛超市太原店，一种为无辣椒成分的榨菜，另一种为有辣椒成分的榨菜。

细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 仪器与设备

TC-96（G）H（b）B Life Touch基因扩增仪 杭州博日科技有限公司；梯度凝胶电泳仪、凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 取样

取同一批次的两种榨菜样品各3 份，保存于4 ℃冰箱中待用。

1.3.2 榨菜卤食盐浓度及亚硝酸盐含量的测定

用硝酸银滴定法测定榨菜卤食盐浓度，以铬酸钾为滴定终点指示剂［14］；按照GB 5009.33—2010《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的方法测定亚硝酸盐含量［15］。

1.3.3 榨菜卤中细菌总DNA的提取

按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书方法提取出两种榨菜中细菌的总DNA，保存于－20 ℃冰箱中备用。

1.3.4 细菌16S rDNA V7～V8片段的扩增

16S rDNA V7～V8片段的引物如下：WBAC1：5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGC CCCCGCCCCCCCGGGAACGTATTCACCGCG-3′；WBAC2：5′-GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA-3′［11］。反应体系总体积25 μL：Mix 12.5 μL、引物1 μL、榨菜总DNA 1.5 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 8 min，30 个循环。最后于4 ℃恒温保存。取PCR产物各5 μL，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察。

1.3.5 DGGE分离16S rDNA

将样品和荧光染色液按5∶1（V/V）比例上样电泳，DGGE分离（凝胶配方见表1）后于凝胶成像系统分析、拍照。将每条可看到的电泳带切割回收，溶胶后作为模板通过PCR扩增16S rDNA V7～V8片段，纯化后与pGM-T载体进行连接，转化感受态细胞。将检测到的阳性克隆送至华大基因公司进行基因序列测定。

表 1 变性梯度凝胶配方Table 1 DGGEgelcomposition试剂 下层胶 上层胶（8%）35% 60% 40%双丙烯酰胺加入量/mL 20 20 2 50×TAE Buffer加入量/mL 2 2 0.2去离子甲酰胺加入量/mL 14 20尿素加入量/g 14.7 21总体积/mL 100 100 10

1.3.6 DGGE条带结构多样性分析

使用Quantity One软件进行DGGE条带分析，每个条带的位置和相对光密度值由该软件自动分析确定。为了最大程度降低DGGE过程中不同样品间DNA上样浓度的差异，将每个条带的光密度峰值除以该条带所在泳道所有条带光密度峰值的平均值，进行数据的标准化处理。每条泳道内的条带数量用以评价物种丰富度指数（R），并通过条带相对密度值计算物种均匀度指数（E）及物种多样性指数（Shannon指数，H）［16］，计算公式如下：

式中：ni为单一条带的峰面积；N为某一泳道所有峰面积；S为某一泳道的总条带数。

1.3.7 测序结果同源性比较

对测序结果进行去载体及目的片段筛选，将得到的目的片段序列提交到GenBank中进行BLAST比对，获得与目的片段相似度高的序列。

2 结果与分析

2.1 榨菜中的食盐浓度和亚硝酸盐含量

表 2 两种榨菜中的食盐浓度及亚硝酸盐含量Table 2 Salt contents in different pickled mustard tuber samples榨菜种类 不含辣椒 含有辣椒食盐浓度/（mol/L） 0.45±0.01 0.33±0.12亚硝酸盐含量/（mg/kg） 2.80±0.08 2.40±0.07

如表2所示，两种榨菜中，不含有辣椒的榨菜食盐浓度及亚硝酸盐含量稍高于含有辣椒的榨菜。两种榨菜中亚硝酸含量均远低于GB 2762—2012《食品安全国家标准 食品中污染物限量》中规定的蔬菜及其制品腌渍蔬菜中亚硝酸盐限量指标（20 mg/kg），处于国家标准安全限量范围内。

2.2 PCR-DGGE结果

2.2.1 榨菜中16S rDNA基因V7～V8片段的PCR扩增结果

为了研究榨菜中乳酸菌的多样性，用乳酸菌引物对提取的总DNA进行PCR扩增，结果如图1A所示，电泳条带很清晰，没有多余杂带，说明提取的DNA可以用于DGGE分析。

2.2.2 榨菜16S rDNA基因V7～V8片段的PCR-DGGE图谱分析

图1B为榨菜乳酸菌的16S rDNA基因V7～V8片段的PCR-DGGE图谱，图中每个样品的每个条带都代表一个物种，样品条带的明亮程度表示乳酸菌数量的多少，条带的多少代表乳酸菌的多样性。不含有辣椒的样品有5 条PCR-DGGE泳带，初步说明无辣椒榨菜中有5 种乳酸菌；含有辣椒的榨菜有4 条PCR-DGGE泳带，初步说明含辣椒榨菜中有4 种乳酸菌。无辣椒榨菜中乳酸菌数量要比含辣椒榨菜中多，说明添加辣椒可能会影响榨菜中乳酸菌的种类。

2.2.3 DGGE回收电泳条带的分析鉴定

两种榨菜样品的DGGE图谱（图1B）显示，不同样品的电泳带数量和迁移率均不同。为了研究榨菜中的微生物种类，回收DGGE结果的每条电泳条带，通过基因扩增反应后测定碱基序列、与GenBank库序列进行对比鉴定。不含有辣椒的样品的5 条PCR-DGGE泳带a、b、c、d、e分别与Pediococcus argentinicus CRL 776、Uncultured Lactobacillus sp.isolate DGGE gel band lx12、Uncultured bacterium clone 11.02-12、Uncultured bacterium clone 11.02-9、Uncultured Lactobacillus sp.clone PxSC03相似度为98%、96%、97%、97%、97%；含有辣椒的榨菜的4 条PCR-DGGE泳带1、2、3、4分别与Uncultured Lactobacillus sp.、Lactobacillus sakei A156、Lactobacillus sakei YY1、Lactobacillus sakei WJ1相似度为96%、97%、98%、97%（表3）。不含有辣椒榨菜中的非培养微生物含量比含有辣椒榨菜中多，且有片球菌属Pediococcus argentinicus存在；含有辣椒的榨菜中出现了乳酸杆菌属Lactobacillus，且数量较多。以上结果说明含有辣椒的榨菜与不含辣椒的榨菜乳酸菌系不同。

表 3 发酵榨菜细菌群落的DGGE图谱条带测序结果Table 3 DGGE patterns of bacterial community of pickled mustard tuber榨菜种类 测序条带 与GenBank中已发表文献同源性比较 相似度/%不含辣椒榨菜a Pediococcus argentinicus CRL 776 98 b Uncultured Lactobacillus sp.isolate DGGE gel band lx12 96 c Uncultured bacterium clone 11.02-12 97 d Uncultured bacterium clone 11.02-9 97 e Uncultured Lactobacillus sp.clone PxSC03 97含辣椒榨菜1 Uncultured Lactobacillus sp. 96 2 Lactobacillus sakei A156 97 3 Lactobacillus sakei YY1 98 4 Lactobacillus sakei WJ1 97

2.2.4 榨菜中乳酸菌群落特征

物种多样性指数（H）、均匀度指数（E）和丰富度指数（R）是应用数学方法来度量组成群落的种类数、个体总数以及各种群均匀程度的数量指标，从不同角度反映群落结构特征的量度值，表明群落的组织结构及其生态学特征，反映群落类型的不同、群落结构的差异、群落演替的动态变化［16］。使用Quantity One软件进行DGGE条带分析，每条泳道内的条带数量用以评价物种丰富度，并通过条带相对密度值计算物种均匀度及物种多样性。

注：同列小写字母相同表示差异不显著（P＞0.05）。

如表4所示，含有辣椒的榨菜和不含辣椒的榨菜两者间多样性指数、丰富度指数和均匀度指数均无显著差异（P＞0.05），说明辣椒对榨菜中微生物群落结构的影响无显著差异。

3 讨 论

蔬菜发酵初期首先是附着在原料表面的杂菌不断生长繁殖，主要有非肠道菌属、酵母菌属，也有肠道细菌属等，同时乳酸菌也随之增殖［17］。随着发酵的进行，杂菌的种类和数量减少，乳酸菌数量迅速增加，占细菌总数的比例不断增加。发酵后期，发酵蔬菜中的微生物主要是乳酸菌［18-20］。本实验以市场成熟的榨菜为材料，通过对DGGE回收电泳条带的分析鉴定可知，不含有辣椒的榨菜中有片球菌属Pediococcus argentinicus存在；含有辣椒的榨菜中有乳酸杆菌属Lactobacillus，含有辣椒与不含有辣椒的两种榨菜菌中均含有乳酸菌，这说明基于DGGE分析蔬菜发酵体系微生物群落的结果与大量研究得出蔬菜发酵微生物变化的规律相符，即蔬菜发酵后期乳酸菌为主要微生物。

本实验在含有辣椒的榨菜中检测到了Lactobacillus sakei的存在。Lee等［21］以PCR结合DGGE的方法鉴定了韩国发酵白菜中主要的微生物为Weissella confusa、Leuconostoc citreum、Lactobacillus sakei和Lactobacillus curvatus，这可能是由于韩国发酵白菜与榨菜的原料和加工方法不同所致。

本课题组之前的研究表明泡菜中的乳酸菌能够降解亚硝酸盐［22］，Park等［23］也报道了Kimchi（韩国泡菜）发酵过程中乳酸菌可降解大量亚硝酸盐。本实验发现含有的辣椒榨菜中亚硝酸盐含量低于不含辣椒的榨菜，这是否由于含有辣椒的榨菜中乳酸杆菌属Lactobacillu数量与不含有辣椒的榨菜乳酸菌数量不同引起，尚有待进一步研究。

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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613024 10.7506/spkx1002-6630-201613024. http://www.spkx.net.cn

中图分类号：TS201.3

文献标志码：A

文章编号：1002-6630（2016）13-0136-04

收稿日期：2015-08-26

基金项目：国家自然科学基金面上项目（31171743）；山西省基础条件平台项目（2014091003-0107）

作者简介：燕平梅（1968—），女，教授，博士，主要从事微生物生态学研究。E-mail：yanpingmei1968@163.com

PCR-DGGE Analysis of Lactic Acid Bacterial Community Structure in Pickled Mustard Tuber

YAN Pingmei1， QIAO Hongping1， ZHAO Wenjing1， SHAN Shuhua1， WANG Qi2， CHAI Zheng1， CHEN Yanfei1
（1.Department of Biology， Taiyuan Normal University， Taiyuan 030619， China；2.College of Life Science， Shanxi University， Taiyuan 030031， China）

Abstract:In order to understand the diversity of lactic acid bacteria in pickled mustard tuber and its influencing factors， two commercial bagged pickled mustard tubers （with and without hot pepper） were determined for the contents of salt and nitrite，and the V7-V8 region of total bacterial 16S rDNA sequences was separated by denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE）.Furthermore， the species richness， evenness and diversity of lactic acid bacteria were analyzed by the Quantity One software.Results indicated that the contents of salt and nitrite in the first sample were slightly lower than in the second sample.However， no significant difference in species richness， evenness and diversity was observed between both samples （P > 0.05）.The target DGGE bands were recovered， cloned and sequenced by comparison with the sequences published in the GenBank after PCR amplification.A total of 5 bands from the DGGE gel of the second sample were recovered and identified as Pediococcus argentinicus CRL 776， uncultured Lactobacillus sp.isolate DGGE gel band lx12， uncultured bacterium clone 11.02-12， uncultured bacterium clone 11.02-9， and uncultured Lactobacillus sp.clone PxSC03 with a similarity of 98%， 96%， 97%， 97%， and 97%， respectively.Four bands from the first sample were recovered and identified as uncultured Lactobacillus sp.， Lactobacillus sakei A156， Lactobacillus sakei YY1， and Lactobacillus sakei WJ1 with a similarity of 96%， 97%， 98% and 97%， respectively.These results show that hot pepper has little effect on the microbial community structure of pickled mustard tuber.

Key words:pickled mustard tuber； nitrite； lactic acid bacteria； polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis （PCR-DGGE）