Nd：YAG激光对天然牙根管内大肠杆菌杀菌效果的体外实验*

邢莉，黄茜，潘英瑜，张赓辉，吴多荣，文小俊

（中南大学湘雅医学院附属海口医院 1.口腔医学中心牙体牙髓病科，2.检验科，海南 海口 570208）



Nd：YAG激光对天然牙根管内大肠杆菌杀菌效果的体外实验*

邢莉1，黄茜1，潘英瑜1，张赓辉1，吴多荣2，文小俊1

（中南大学湘雅医学院附属海口医院 1.口腔医学中心牙体牙髓病科，2.检验科，海南 海口 570208）

摘要：目的建立大肠杆菌离体天然牙根管感染模型，评价脉冲Nd：YAG激光对感染根管内大肠杆菌的杀菌效果。方法将感染3周的30颗离体前牙随机分为5组，每组6颗牙齿。A组1.5W激光照射1次，作用30s；B组2.1W激光照射1次，作用30s；C组2.1W激光重复照射3次，每次30s，间隔15 s；D组2.5%次氯酸钠NaOCl冲洗后2.1W激光重复照射3次，每次30s；对照组单纯用2.5%NaOCl冲洗。每组标本在照射、冲洗前后根管内即刻取样行细菌培养，48h后计数菌落数（CFU/ml），比较根管内大肠杆菌的杀灭效果。结果Nd：YAG激光和2.5%NaOCl照射、冲洗后根管内细菌量均显著下降。各组根管内细菌减少量比较差异有统计学意义。A组与B组比较差异无统计学意义（P>0.05），分别与C组、D组、对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）；C组与D组比较差异有统计学意义（P<0.05），与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）；D组与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论Nd：YAG激光和2.5%NaOCl对根管内大肠杆菌具有杀菌作用，两者联合使用杀菌作用更强。

关键词：Nd：YAG激光；大肠杆菌；次氯酸钠；菌落计数

混合细菌感染是牙髓病和根尖周病的主要病因，从炎症牙髓、感染根管到根尖周病变，根管内细菌种类增多，毒力也不断增强。在根管内细菌主要以生物膜的形式存在，能抵抗宿主的免疫反应及药物的作用，具有更强的致病性[1-3]。目前，主要通过机械预备清除和药物冲洗、消毒控制根管内感染，而采用脉冲Nd：YAG激光进行根管内消毒杀菌的文献报道及临床应用较少。本实验建立大肠杆菌根管感染模型，采用不同剂量和作用时间的脉冲Nd：YAG激光进行根管消毒，评价其杀菌效果，为临床更好地控制根管内感染，提高根管治疗成功率提供快速而有效的方法。

1　资料与方法

1.1主要材料和仪器

ATCC25922大肠杆菌标准菌株购自中国微生物菌种保藏中心，中国蓝琼脂培养基购自北京陆桥技术有限公司，HSM-Ⅲ型脉冲Nd：YAG激光治疗仪购自四川航天制导公司，HH.W21.600型恒温水浴培养箱购自浙江余姚市东方电工仪器厂。

1.2离体牙准备

选择因牙周病拔除的上颌中切牙34颗，单根管、根尖孔发育完全，未做过牙髓治疗，牙根无裂痕。去除牙根周围的牙结石，截除牙冠保留牙根，标准化长度为15mm，根管预备后复合树脂封闭根尖孔。

将制备好的牙齿打包高温高压灭菌，随机选取2标本取样检测无细菌生长后确定根管内已灭菌彻底。解冻复苏大肠杆菌标准菌株，接种于中国蓝琼脂培养基培养24 h增菌。在生物安全柜内，用营养肉汤调取McFarland为2（6.0×108CFU/ml）的菌液，接种于无菌根管内，每根管注入菌液40μl。37℃恒温水浴培养箱中培养，隔日根管内更换新鲜菌液。感染20d时随机抽取1标本菌液转种于中国蓝琼脂培养基，37℃细菌恒温培养箱中培养，24h后根据培养基上长出的菌落形态和革兰染色特征，用细菌鉴定仪进行生化鉴定确定无杂菌污染，再将感染3周（21d）[4]的标本纳入进一步实验。随机抽取2标本行扫描电镜，观察大肠杆菌感染根管的情况。

1.4实验分组

经电镜观察、细菌学检查、生化鉴定确定根管内已被纯培养的大肠杆菌感染而无杂菌污染，按随机数字表法将30颗上颌中切牙标本分为A、B、C、D及对照组，每组6个标本。

1.5感染模型的细菌培养计数

第1次取样：无菌纸尖吸干各组标本根管内的培养液，注入无菌生理盐水。40号无菌纸尖插入根管中停留1 min，吸取根管内液，立即放入装有1 ml无菌生理盐水的试管中，混匀，10倍系列稀释，分别取1×10-4、1×10-5稀释度标本50μl接种于中国蓝琼脂培养基，37℃细菌恒温培养箱中培养48 h后计数菌落数（CFU/ml）。

1.6Nd：YAG激光照射、次氯酸钠NaOCl冲洗感染模型后的细菌计数

第2次取样：A、B组用Nd：YAG激光照射1次，时间30s，剂量分别为1.5和2.1W；C组2.1 W激光重复照射3次，每次30s，间隔15s。激光照射时选择直径为0.3 mm光纤头插入感染根管距根尖孔2 mm处，以上下垂直方向、接触式沿根管壁四周均匀照射。D组先用5 ml 2.5%NaOCl冲洗，在2 min内完成，再用2.1W激光重复照射3次，每次30s。对照组只用5ml 2.5%NaOCl冲洗，在2 min内完成。无菌纸尖吸干根管，即刻往各组标本根管内注入无菌生理盐水，用纸尖吸取根管内液，放入装有1 ml生理盐水的试管中，混匀，10倍系列稀释，取稀释标本50μl分别接种于中国蓝琼脂培养基，培养48 h后计数菌落数。

1.7细菌复苏实验

要搞好测水量水工作，首先要选定测流站、点。布置测流站、点的原则是：渠段断面规则稳定，不受壅水影响，宽度、深度、比降大致相同；测段渠底和岸坡无草木；附近无影响水流的建筑物，无退水和分水渠、无支流汇入；便于观测和修理测水设备。测水的方法主要有三角堰、梯形堰、巴歇尔量水槽、无喉量水槽、水工建筑物量水、流速仪、浮标、利用标准渠段测流、现我们使用的是自动化测水与遥测测流法。

第2次取样完成后在所有标本根管内注入营养肉汤培养72h，无菌纸尖吸取根管内液，置于中国蓝琼脂培养基培养是否有细菌生长。

1.8扫描电镜标本观察

将2标本置于2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液中4℃固定保存4h。高速金刚砂车针沿标本牙根长轴制备2条纵形深沟，劈开牙根暴露根管内牙本质壁。乙醇梯度脱水，二氧化碳CO2临界点干燥，离子溅射仪喷金，扫描电镜观察根管内大肠杆菌感染情况。

1.9统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，将细菌计数结果（CFU/ml）加1后做对数转换，即lg（CFU/ml+ 1），方差分析和多重比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1扫描电镜观察

感染3周后，根管腔内可观察到互相结合的大肠杆菌细菌微集落，细菌间出现丝状纤维连接，形成成熟、稳定的生物膜（见附图A、B），细菌入侵牙本质小管深处（见附图C、图D）。

附图　3周后大肠杆菌感染根管情况

2.2菌落计数

经重复测量设计的方差分析可知，照射或冲洗前后各组根管内细菌减少量比较，差异有统计学意义（F=25.716，P=0.000）。照射或冲洗前后各组根管内细菌减少量两两比较，A组与B组比较差异无统计学意义（P=0.680），A组与C组、D组、对照组比较，差异有统计学意义（P=0.000）；C组与D组比较，差异有统计学意义（P=0.002），C组与对照组比较，差异无统计学意义（P=0.519）；D组与对照组比较，差异有统计学意义（P=0.011）。照射、冲洗前后即刻菌落计数及菌落计数差值见附表。

2.3细菌复苏实验

经72 h复苏后，所有标本都显示根管内无杂菌污染，检测见有大肠杆菌再生长。

附表　5组根管照射或冲洗前后根管内细菌量的变化（n=6，x±s）

3　讨论

扫描电镜观察感染3周的标本可见单一的大肠杆菌菌种在离体牙根管内形成生物膜，并不同程度入侵牙本质小管深处。生物膜状态存在的细菌较游离悬浮状态更不易被机械和化学预备清除，在根管内长期存在导致持续感染[5]。而牙本质小管的直径为1～4μm，直径大多<1μm的细菌可轻易入侵并隐匿其中，躲避各种清除，在条件允许时再次进入根管腔引起感染，故有效地清除根管内细菌是提高根管治疗成功率和降低再感染几率的重要手段。

通过机械预备可以去除根管内的坏死牙髓组织、大部分细菌和根管内壁的感染物，但对侵入牙本质小管深处、侧支根管、根管峡部和交通支等细微结构内的细菌及其产生的毒素，器械难以达到及清除[6]。同时，为达到控制感染的目的，过度的机械切割将降低根管牙本质壁的强度，提高牙根折裂的几率[7]。药物冲洗只对接触、渗透到的区域有杀菌效应，其表面张力限制在根管系统狭窄部位扩散和清理，抗菌效果与药物浓度、药物使用量相关[8]。目前，应用较多的根管消毒药物氢氧化钙制剂具有良好的杀菌性，但氢氧化钙消毒作用有赖于与牙本质的直接接触，能与根管壁紧密贴合是其发挥功效的首要条件[9]。而根管系统解剖结构复杂，药物无法充盈整个根管系统从而影响其充分的杀菌效能。

脉冲Nd：YAG激光是波长为1064nm的近红外激光，穿透力强，定位准确，与生物体作用可产生多种效应，其产生的光热效应、光化效应等能迅速杀灭细菌，灭活其代谢产物，改变或破坏微生物大分子原有结构致其死亡[10]。其可弯曲的光纤输出末端，能够插入根管至根尖孔区，操作方便，在根管治疗尤其是根管消毒中具有优势[11]，近年来受到关注。

本实验采用脉冲Nd：YAG激光照射或NaOCl冲洗大肠杆菌根管感染模型，菌落计数结果显示各组根管内细菌量明显减少。A组与B组的菌落计数差值比较，差异无统计学意义，而C组采用2.1 W激光重复照射3次后，菌落计数差值明显增大，与A组、B组比较差异有统计学意义，表明激光重复照射比单次照射可取得更好的杀菌效果。提示临床使用激光进行根管消毒时，为达到更好的杀菌效应而又避免激光光热效应对牙根周围组织的热损伤，可在照射剂量安全值范围内，采用一定间隔期的重复照射，减少每次照射的持续时间。

C组与对照组比较差异无统计学意义，但两种方法结合使用即D组杀菌效果明显优于单纯激光照射或消毒冲洗，为5组中效果最好。考虑与NaOCl对浸润到的根管腔内的细菌具有较强的杀菌能力，而激光能去除根管内碎屑和玷污层[12]，具有一定的消毒深度，对牙本质小管深处及根管交通支等细微结构内的细菌杀菌力更强有关[13-14]，两者联合使用可互为补偿，相互增效，从而达到更好的抗菌效果。对临床难治性牙髓感染性疾病，采取NaOCl冲洗结合激光照射能产生协同抗菌效应，是提高临床疗效的较佳消毒方式。

在激光照射或NaOCl冲洗后所有标本根管内加入营养肉汤培养72h，取样检测均有细菌生长。提示无论是激光还是NaOCl均不能完全杀灭根管内细菌，使根管处于灭菌状态。激光杀菌作为传统根管消毒方式的补充，利用其优势，与机械预备、药物冲洗消毒等方法联合使用，破坏根管内细菌生物膜结构，控制主根管、牙本质小管、管间交通支等部位的细菌，使根管系统内细菌数量降至最小，达到尽可能彻底清创的效果，从而保证感染根管治疗的远期疗效，降低再感染的几率。

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（申海菊编辑）

中图分类号：R 781.05

文献标识码：B

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.13.018

文章编号：1005-8982（2016）13-0092-04

收稿日期：2015-10-26

*基金项目：海口市重点科技计划项目（No：2009-049-4）

In vitro experiment of antibacterial effect of Nd:YAG laser onEscherichia coliwithin tooth root canals*

Li Xing1，Xi Huang1，Ying-yu Pan1，Gen-hui Zhang1，Duo-rong Wu2，Xiao-jun Wen1
（1.Endodontic Department of Stomatology Center，2.Department of Laboratory Medicine，the Affiliated Haikou Hospital，Xiangya Medical School，Central South University，Haikou，Hainan 570208，China）

Abstract:Objective To evaluate the antibacterial effectiveness of Nd:YAG laser forEscherichia coli in infectious tooth root canalsin vitro.Methods Thirty anterior teeth inoculated withEscherichia coli for 3 weeks were randomly divided into 5 groups with 6 teeth in each group.In the experiment group A 1.5 W laser dose was applied to root canals for 30 s.In the group B 2.1 W laser dose was applied for 30 s.In the group C 2.1 W laser dose applied for 3 times，30 s for each irradiation time with an interval of 15 s.In the group D after the teeth were washed by 2.5%sodium hypochlorite，2.1 W laser was applied for 3 times，30 s each time.In the control group E the teeth were only washed by 2.5%sodium hypochlorite.Microbiological samples were collected from root canals for bacterial culture immediately before and after irradiation or irrigation，and the colony-forming units（CFU）were counted after 48 h to compare the effect of killingEscherichia coli in root canals.Results The bacteria in root canals significantly decreased after irradiation and/or irrigation，the differences were significant in each group.Pairwise comparison of the reduction of bacteria in root canals of each group was used.There was no statistical difference between the groups A and B（P＞0.05），but both group A and group B had significant differences from the groups C，D and E respectively（P＜0.05）. The group C had significant difference from the group D（P＜0.05），but had no significant difference from the control group（P＞0.05）.The group D had significant difference from the control group（P＜0.05）.Conclusions Both Nd:YAG laser and 2.5%sodium hypochlorite have antibacterial effects onEscherichia coliwithin root canals，and their combination is more effective.

Keywords:Nd:YAG laser；Escherichia coli；sodium hypochlorite；colony counting