刘扬
(三峡大学第一临床医学院 骨外科,湖北 宜昌 443000)
论著
白细胞介素-24基因在膝关节骨性关节炎发病中的作用及意义
刘扬
(三峡大学第一临床医学院 骨外科,湖北 宜昌 443000)
摘要:目的探讨白细胞介素-24(IL-24)基因在膝关节骨性关节炎(KOA)疾病中的作用及意义,为KOA的早期诊断及基因治疗提供一定的科学依据。方法选择该医院骨科原发性KOA的滑膜标本,提取总R NA,用实时逆转录聚合酶链反应(R eal-time R T-PCR)检测KOA滑膜组织中IL-24基因的表达。结果IL-24基因表达在KOA滑膜组织中降低(P<0.01)。结论IL-24在膝关节骨性关节炎滑膜中的表达降低,且与KOA病变关系密切,为将来诊断和基因治疗膝关节骨性关节炎疾病提供参考。
关键词:膝关节骨性关节炎;IL-24;基因
骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)是发生于老年人群中的一种慢性退行性关节疾病,使患者逐渐散失关节功能[1]。其主要特点是软骨下骨的改变、关节软骨的破坏、细胞外基质的减少及滑膜炎性的改变。其特征是骨赘的形成和软骨下骨的破坏[2]。年龄、肥胖、外伤、性别等是引起OA的常见风险因素[3]。在临床上最为常见的是膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis,KOA),其发病率最高,是一组病因不同,但是有相似的生物学、形态学和临床表现的疾病[4]。KOA主要损害关节软骨、半月板、软骨下骨及滑膜等关节组织,容易引起软骨代谢的变化。膝关节骨性关节炎是一种自身炎症反应,可以引起分解代谢和软骨细胞的凋亡,从而导致软骨的降解[5-6]。研究表明,KOA发生、发展的过程与多种细胞因子和生长因子有关,如白细胞介素-1(Interleukin-1,IL-1)家族、转移生长因子、炎症因子等[7]。白细胞介素是一种在细胞间发挥免疫调节作用的细胞因子,可以对免疫反应起刺激或者抑制作用,其主要由单核细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞产生。IL-24是一种抑制炎性白细胞介素,在骨性关节炎发病中起重要作用。IL-24由外周血单核细胞、B细胞、T细胞等免疫细胞,以及黑色素细胞、皮肤角化细胞、结肠浆膜下肌成纤维细胞等[8-9]非免疫细胞分泌。研究发现,IL-24除具有抑制肿瘤作用,还参与银屑病、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的免疫病理过程[10-11]。总体来说,KOA是多种细胞因子相互调节引起的复杂病理过程。目前,还没有IL-24与KOA的相关性及机制的系统性研究,本文通过IL-24基因在膝关节骨性关节炎发病中的作用研究,为KOA的发病机制研究和进一步的基因治疗提供依据。
1.1一般资料
1.1.1KOA组选取2010年1月-2012年12月在本院骨科就诊的膝关节骨性关节炎患者42例,男性22例,女性20例,平均年龄(61.00±2.12)岁,取膝关节滑膜标本作为KOA组实验标本。
1.1.2对照组选取2010年1月-2012年12月在本院体检,未患过膝关节骨性关节炎、创伤性截肢的患者32例。其中男性18例,女性14例;平均年龄(51.00±1.49)岁,取其膝关节滑膜组织来作为对照组的实验标本。
1.1.3标本存放KOA组和对照组的实验标本取出后,直接置于无菌的装有液氮的冻存管中,30min后存于-80℃冰箱冷冻保存中。
1.2诊断及纳入标准
1.2.1诊断标准满足美国风湿协会的标准:患者具有膝关节疼痛,患膝X线检查可以发现骨赘;受累的膝关节晨僵<30 cm;有骨擦声音,在近1个月内有膝关节疼痛。
1.2.2纳入标准筛选本院骨科年龄>50岁的原发性KOA患者,患者符合Ahlback膝关节骨性关节炎分级标准中关节间隙消失、轻度骨磨损、中度骨磨损(磨损0.5~1.0cm)的表现。
1.3实验试剂
M-MLV转移液(美国Invitrogen公司),dNTP混合液(日本TaKaRa公司),RNase合成酶抑制剂Inhibitor(美国Promega公司),TRIzol提取液(美国Invitrogen公司),RQI无RNase活性的DNA酶(美国Promega公司),RNeasy提取试剂盒(德国QIAGEN公司),SYBR GreenⅠ嵌合荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)混合液(美国Applied Biosystems公司),ABI荧光定量PCR仪专用96孔板(美国Applied Biosystems公司),ABI荧光定量PCR仪专用封板膜(美国Applied Biosystems公司),引物(9N逆转录引物PCR引物)(美国Invitrogen公司)。
1.4实验仪器
小型台式高速离心机5415D(德国Eppendorf公司),离心机581OR(德国Eppendorf公司),梯度PCR(德国Eppendorf公司),多孔道DNA检测仪PTC-225(美国MJ公司),凝胶成像系统CBC/UVP I-DOOl(北京CapitalBio公司),分光光度计ND-1000(美国Nano Drop公司),7900HT实时定量PCR(美国Applied Biosystems),移液枪P-2.5,P-20,P-200,P-l000(德国Eppendorf公司)。
1.5实验方法
1.5.1R NA的提取(Trizol法)用电子天平称0.3~0.5 g取出的组织样本,使用液氮预冷的研钵来研磨,为使组织不融化,研磨过程中注意随时添加液氮;按组织∶Trizol=100∶1的比例加入Trizol,继续研磨组织使其至比较细的粉末,转入超净工作台,等融化后,把液体转移到体积为1.5ml的离心管中,每管大约1 ml,室温下将其放置>15 min;按照氯仿∶Trizol=0.2∶1.0的比例加入氯仿,将其游祸震荡30 s混匀,室温下放置2~3 min,再在4℃、15 000 r/min离心15 min;将离心后得到的上清液转移到一个新Eppendorf管,按照异丙醇∶Trizol= 0.5∶1.0的比例加入异丙醇,混匀,在-20℃放置> 10 min,4℃、15 000 r/min离心15 min;将异丙醇弃掉,加入1 ml 75%乙醇,用手指弹起沉淀块,颠倒几次,4℃、7500r/min离心5 min;将75%乙醇弃掉,在超净台中自然干燥15~30min;视RNA沉淀大小加入一定体积的无核酸酶水,65℃助溶5~10 min;置入-20℃冰箱冷冻保存,在-80℃长期冷冻保存。
1.5.2cDNA第一链的合成取2μg RNA置于反应管中,加入Oligo dT 1μl,再加入2.5 mmol dNTP mix 4μl,混匀,加ddH2O至13μl。在60℃条件下静置10 min后,放在冰上放置>1 min。在反应管中加入5×第一链缓冲液4μl,0.1 mol二硫苏糖醇(DL-dithiothreito,DDT)1μl,RNaseout(40u/μl)1μl,SuperscriptⅢRT 1μl,震荡混匀后离心,70℃条件下通过灭活逆转录酶,合成cDNA第一链,4℃条件下保存。
1.5.3实时逆转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription-polymerasechainreaction,R eal-time R T-PCR) ①逆转录反应体系和反应程序见表1;②逆转录终止反应程序:在70℃条件下加入5μl 1.5mol Na(OH)来终止逆转录反应,反应10 min后,加入1μl 10mol乙酸以发生中和反应,再加入无核酸酶水至50μl,在4℃可以短期低温保存,在-80℃下能够长期低温保存。
1.5.4R eal time PCR反应①Real time PCR反应体系见表2;②Real time PCR反应程序见表3;③Real time PCR产物1.5%非变性琼脂糖凝胶电泳检测见表4。1.5%非变性琼脂糖凝胶电泳检测条件:120V,15~20min。1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测条件:120~130V,15~20min。
1.6统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,用t检验,计数资料以率表示,用χ2检验,用直线相关回归描述IL-24 mRNA的相对表达量与KOA病程的相关性,用散点图描述两者的相关性,P<0.05为差异有统计学意义。
2.1两组患者一般情况比较
KOA组和对照组在性别、年龄方面比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。
2.2RT-PCR检测不同组织中IL-24 mRNA表达的电泳图
人膝关节骨性关节炎滑膜组织与正常滑膜组织表达IL-24 mRNA的Real-time RT-PCR检测电泳图见图1。
2.3Real-time RT-PCR分析
Real-time RT-PCR反应结果表明,两组IL-24基因表达比较,经t检验,差异有统计学意义(t= 19.263,P=0.000),KOA组较对照组IL-24基因表达降低。见图2。
2.4IL-24 mRNA统计学分析
KOA组IL-24 mRNA的表达值为(0.051± 0.006),对照组为(0.940±0.070),经t检验,差异有统计学意义(t=5.734,P=0.001),KOA组低于对照组。
表1 Real-time RT-PCR逆转录反应体系及反应程序
表2 Real Time PCR反应体系
表3 Real Time PCR反应程序
表4 Real time PCR产物1.5%非变性琼脂糖凝胶电泳检测
2.5IL-24 mRNA相对表达量与KOA病程的相关分析
随着病程的增加即关节磨损程度加重,IL-24 mRNA相对表达量减少,表明IL-24 mRNA的相对表达量与KOA病程呈负相关(r=-0.827,P=0.000)。见图3。
表5 两组患者一般情况比较
图1 不同组织中IL-24 mRNA表达的电泳图
图2 两组IL-24 mRNA的相对表达量比较
图3 IL-24 mRNA的相对表达量和KOA病程散点图
膝关节骨性关节炎又称增生性膝关节炎,是指膝关节由于外伤、慢性劳损及关节畸形等引起关节软骨变性、增生,从而导致肿胀、疼痛、伸屈受限等症状的退行性关节疾病。MURPHY等[12]研究表明,1/2的成年人85岁之前患有症状的骨性关节炎。膝关节骨性关节炎易导致软骨代谢的变化,其变化开始于关节软骨结构的变化,滑膜的炎症参与该过程。滑膜炎是体内细胞因子合成释放综合作用的结果,进而影响到关节软骨的改变。滑膜炎是引起早期膝关节骨性关节炎临床症状的主要因素。任红革等[13]通过查阅文献,总结出细胞因子在膝关节骨性关节炎发生、发展过程中发挥重要作用,部分细胞因子能促进骨性关节炎软骨降解、滑膜炎症及软骨下骨的吸收,部分细胞因子也有抑制骨性关节炎病变发展的作用。与分解代谢有关的细胞因子主要有基质金属蛋白酶;与合成代谢有关的细胞因子主要有转化生长因子、骨形态发生蛋白、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子和血管内皮细胞生长因子;在关节组织中发现的影响细胞功能的炎症因子包括白细胞介素、趋化因子和肿瘤坏死因子等。
白细胞介素含促炎症白细胞介素和抑制白细胞介素两类,其在膝关节骨性关节炎中发挥重要作用。促炎症白细胞介素主要有IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-8、IL-17、IL-18等,抑制炎症白细胞介素主要有IL-4、IL-10、IL-13、IL-24等。研究表明,IL-24同肿瘤的抑制、炎症的抑制、损失的修复作用密切相关[14-15]。IL-24对肿瘤的抑制作用比较广泛,能够抑制肺癌、鼻咽癌、宫颈癌等癌细胞的生长[16]。大量对其机制的研究表明,主要从PKR途径、抑制肿瘤血管的生成、抑制肿瘤细胞的侵袭,以及IL-24的免疫调节作用来发挥作用。同时DOMINIK等[17]经免疫组织化学法、迁移分析等研究发现,IL-24在损伤修复过程中,在皮肤角化细胞中表达升高,并抑制由TGF-α引起的促炎症作用。在本研究中通过Real-time RT-PCR检测发现,IL-24基因在膝关节骨性关节炎滑膜中表达显著降低,考虑原因为IL-24的低表达作用能很好地促进TGF-α引起的促炎症反应以及关节软骨的降解作用,从而引起人发生膝关节骨性关节炎。
通过IL-24基因在膝关节骨性关节炎发病中的作用研究,笔者发现,IL-24基因在膝关节骨性关节炎滑膜中表达显著降低,IL-24与KOA的发生、发展过程密切相关。同时对IL-24基因的表达水平研究,能够帮助早期诊断膝关节骨性关节炎,并且对IL-24基因进一步深入研究可以为将来膝关节骨性关节炎的诊断和基因治疗提供参考。
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(童颖丹编辑)
中图分类号:R 684.3
文献标识码:A
DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.13.012
文章编号:1005-8982(2016)13-0063-05
收稿日期:2015-07-09
Expression ofIL24 gene in knee osteoarthritis and its significance
Yang Liu
(Department of Bone Orthopedics,the First College of Clinical Medical Science,China Three Gorges University,Yichang,Hubei 443000,China)
Abstract:Objective To investigate expression and significance ofIL24 gene in the knee osteoarthritis (KOA),and to provide scientific basis for early diagnosis and gene therapy for knee osteoarthritis.Methods Fresh synovial specimens were collected from orthopedic patients in our hospital.Trizol was used to extract total RNA.Expression ofIL24in knee osteoarthritis synovium was detected by RT-PCR.ResultsIL24gene expression in knee KOA synovial tissue obviously decreased(P<0.01).ConclusionsIL24 expression in the synovium of osteoarthritis knee joint obviously declines and is negatively correlated with the progress of KOA. Therefore,it can provide a reference for future diagnosis and gene therapy of knee osteoarthritis.
Keywords:knee osteoarthritis;IL24;gene