C aspase-3、D I APH-3蛋白在浸润性乳腺癌中的作用研究*

张玲玲，张亚男，耿翠芝，丁妍，杨会钗，马力，刘月平

（1.河北医科大学第四医院 病理科，河北 石家庄 050011；2.河北省石家庄市第一医院 功能科，河北 石家庄 050011；3.河北医科大学第四医院 乳腺中心，河北 石家庄 050011）

临床论著

C aspase-3、D I APH-3蛋白在浸润性乳腺癌中的作用研究*

张玲玲1，张亚男2，耿翠芝3，丁妍1，杨会钗1，马力3，刘月平1

（1.河北医科大学第四医院 病理科，河北 石家庄 050011；2.河北省石家庄市第一医院 功能科，河北 石家庄 050011；3.河北医科大学第四医院 乳腺中心，河北 石家庄 050011）

目的探讨浸润性乳腺癌组织中C as pas e-3、D IAPH-3蛋白的表达与临床病理特征及预后的关系。方法采用免疫组织化学El i Vi s i on法检测C as pas e-3、D IAPH-3在浸润性乳腺癌（n=240）及癌旁组织（n=44）中的表达情况，并分析其与临床病理特征及预后的关系。结果C as pas e-3、D IAPH-3在浸润性乳腺癌组织中表达的阳性率（36.7%和40.8%）低于癌旁组织（81.8%和86.7%），P＜0.05。C as pas e-3的阳性表达率随淋巴结转移数的增多、肿瘤长径的增加、临床分期的提高、脉管瘤栓的产生及P53的阳性表达的增强而降低。D IAPH-3的表达随淋巴结转移数的增加、脉管瘤栓的产生及临床分期的提高而降低。Kapl an-M ei er单因素生存分析显示C as pas e-3和D IAPH-3蛋白阳性组患者的5年生存率（95.5%、95.8%），高于阴性组（85.5%、84.5%）。C O X多因素生存分析显示D IAPH-3阴性表达与患者不良预后正相关（O R＾=1.687，95%C I:1.032，2.758）。结论浸润性乳腺癌组织中C as pas e-3、D IAPH-3蛋白表达均低于癌旁正常乳腺组织，两者均与乳腺癌的进展及预后密切相关，但两者之间无关联；D IAPH-3的低表达提示患者预后不良，可能是预测乳腺癌患者预后的独立因素之一。

浸润性乳腺癌；C as pas e-3；D IAPH-3；预后

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，普遍认为其发生、发展及预后是一个多因素、不同基因共同参与下的复杂病理过程。肿瘤细胞凋亡及增殖的失衡，促进乳腺癌的发生、发展。Caspase-3是Caspase家族的重要成员，是细胞凋亡过程中的关键效应因子，参与多种因素诱导的细胞凋亡。近来研究显示Caspase-3在多种恶性肿瘤中表达均低于正常组织，并且是预测肿瘤预后的有效因子之一［1-4］。DIAPH-3属于Form i n蛋白家族，是构成细胞骨架的肌动蛋白结合蛋白，其具有催化肌动蛋白单体成核及促进肌动蛋白丝延伸的作用。研究发现，DIAPH-3蛋白在癌细胞中表达下调或缺失使细胞侵袭、转移能力明显增强［5］。两者的表达与乳腺癌预后的关系如何国内外报道较少，本研究探讨乳腺癌中Caspase-3及DIAPH-3的表达情况与患者临床病理特征及预后的关系，以期为乳腺癌的防治及预后评估提供新的初步实验依据。

1　资料与方法

1.1临床资料

选取2009年1月1日-2009年12月31日于河北医科大学第四医院原发浸润性乳腺癌患者手术切除后的乳腺癌组织240例，肿瘤组织经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，所有患者术前均未接受过正规放、化疗及内分泌等治疗，并有完整的临床随访资料，以电话方式随访，随访时间自手术之日起到末次随访日，随访率100%。按照国际抗癌联盟和美国癌症联合会联合发表的第七版临床分期进行分期。所有患者均为女性，年龄20～83岁，中位年龄51岁，Ⅰ期病理32例，Ⅱ期病理178例，Ⅲ期病理30例。

1.2主要试剂

El i Vi si on二抗及DAB显色试剂盒由福州迈新生物技术有限公司提供，兔抗人Caspase-3及兔抗人DIAPH-3多克隆抗体分别购自Prot ei nt ech和北京西雅金桥生物技术有限公司。

1.3方法

1.3.1免疫组织化学El i Vi s i on法石蜡包埋的组织，4μm连续切片，行H E染色和免疫组织化学染色。采用高压法进行抗原修复，严格按说明书步骤操作，每次免疫组织化学染色均设同步阳性和阴性对照（Caspase-3阳性对照为肺腺癌组织，DIAPH-3阳性对照为宫颈鳞状细胞癌组织，阴性对照均用PBS代替一抗）。

1.3.2结果判读标准光镜下观察，40倍物镜镜下随机选取10个以上视野范围，每个视野范围200个以上细胞，染色强度标准：无色为0分；浅黄色：1分；棕黄色颗粒：2分；棕褐色颗粒：3分。染色程度均须与背景对照。阳性细胞百分比标准：阴性为0分；阳性细胞≤10%：1分；11%～25%：2分；26%～50%：3分；≥50%：4分。染色强度与阳性细胞百分比的乘积＞3分为免疫反应阳性［6］。

1.4统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，等级资料应用四格表χ2检验，组间相关性用Spearm an秩相关分析，单因素生存分析用Kapl an-M ei er法，多因素生存分析用COX比例风险模型，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1C aspase-3及D I APH-3蛋白在正常乳腺及浸润性乳腺癌组织中的表达

在正常乳腺组织和浸润性乳腺癌组织中Caspase-3免疫阳性反应产物呈淡黄色或棕色颗粒状，主要位于胞浆，胞核内也可见着色。DIAPH-3的表达呈淡黄色或棕黄色，主要位于胞浆和胞膜（见图1）。正常乳腺组织和乳腺癌组织中Caspase-3阳性表达率分别为81.8%（36/44）和36.7%（88/240），差异有统计学意义（χ2=15.408，P＜0.05）；DIAPH-3的阳性表达率分别为86.7%（38/44）和40.8%（98/240），差异有统计学意义（χ2=15.444，P＜0.05）。

图1　C aspase-3和D I APH-3在正常乳腺导管上皮及浸润性乳腺癌组织中的阳性表达 （El i Vi si on×20）

2.2浸润性乳腺癌中D I APH-3及C aspase-3蛋白的表达与临床病理特征的相关性

Caspase-3在无淋巴结转移组、1～3个淋巴结转移组、3个以上淋巴结转移组的阳性表达率分别为50.0%、41.4%和3.4%，各组间差异有统计学意义（P＜0.05），即Caspase-3的表达与淋巴结转移有关。肿瘤长径≤2.5 cm组和＞2.5 cm组的阳性率分别为47.8%和21.6%，差异有统计学意义（P＜0.05）；有脉管瘤栓组的阳性表达率为43.8%，无脉管瘤栓组的阳性表达率为22.5%，差异有统计学意义（P＜0.05）；Caspase-3的P53阳性组的阳性表达率为27.3%，阴性组的阳性表达率为44.6%，差异有统计学意义（P＜0.05），Caspase-3在乳腺癌组织中的表达与P53负相关；临床分期Ⅰ期阳性率为62.5%，Ⅱ期40.0%，Ⅲ期13.3%，差异有统计学意义，即临床分期越晚，Caspase-3的阳性表达率越低。而其表达与患者的年龄、肿瘤的分化程度及ER/PR/H ER2的阳性率无关（P＞0.05）（见表1）。

DIAPH-3在无淋巴结转移组、1～3个淋巴结转移组、3个以上淋巴结转移组的阳性表达率分别为53.2%、41.4%和13.8%，各组间差异有统计学意义（P＜0.05），即DIAPH-3的表达与淋巴结转移有关。有脉管瘤栓组的阳性表达率为55.0%，高于无脉管瘤栓组的阳性表达率12.5%，差异有统计学意义（P＜0.05），提示DIAPH-3低表达有可能促进肿瘤的侵袭和转移。临床分期Ⅰ期阳性率为50.0%，Ⅱ期为42.7%，Ⅲ期为20.0%，差异有统计学意义，即临床分期越晚，DIAPH-3的阳性表达率越低。其表达与ER/ PR/H ER2及P53的阳性率无关（P＞0.05）（见表1）。

2.3浸润性乳腺癌中C aspase-3与D I APH-3蛋白表达的相关性

88例Caspase-3蛋白阳性表达患者中，DIAPH-3阳性表达36例，阳性表达率为40.9%（36/88）；152 例Caspase-3蛋白阴性表达患者中，DIAPH-3的阳性表达62例，阳性表达率为40.8%（62/152），经Spearm an秩相关分析，两者无相关（P＞0.05）。

表2　浸润性乳腺癌患者C aspase-3与D I APH-3蛋白不同表达组的5年生存率比较

图2　C aspase-3蛋白阴性组与阳性组5年生存率的比较

2.4浸润性乳腺癌中D I APH-3及C aspase-3蛋白的表达与患者预后的关系

单因素生存分析结果表明，浸润性乳腺癌患者中，Caspase-3和DIAPH-3蛋白阳性者5年生存率为95.5%和95.8%，高于阴性组的85.5%和84.5%，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2），两者均为影响浸润性乳腺癌预后的因素，提示检测患者乳腺癌组织Caspase-3和DIAPH-3的表达将可能有助于临床评价患者预后和治疗（见图2、3）。COX多因素生存分析显示，DIAPH-3的表达是影响浸润性乳腺癌预后的独立指标之一（见表3）。

表1　免疫组织化学检测C aspase-3和D I APH-3蛋白表达与临床病理特征的关系

图3　D I APH-3蛋白阴性组与阳性组5年生存率的比较

表3　240例浸润性乳腺癌患者预后影响因素的C O X多因素分析结果

3　讨论

细胞的增殖和凋亡失衡是肿瘤发生发展中的一个重要环节。Caspase-3作为凋亡家族的重要执行者之一，在调亡下游发挥重要作用［7］。有关浸润性乳腺癌组织中Caspase-3的表达情况观点不一，李良宏等［8］认为乳腺癌组织中Caspase-3表达降低，且低表达的患者预后较差，并且与肿瘤的TNM分期和淋巴结转移情况密切相关，是预测乳腺癌患者预后的独立因素之一。薛书霞等［9］的研究结果显示，Caspase-3蛋白在癌组织中的阳性表达率明显低于乳腺增生和乳腺癌旁组织，并随着临床分期增加其阳性表达率下降。但王进京等［10］研究显示Caspase-3在乳腺癌组织中表达阳性率升高。本研究结果表明，乳腺癌组织中Caspase-3蛋白的阳性表达率为36.7%，明显低于癌旁正常组织的阳性表达率81.8%（P＜0.05），提示Caspase-3蛋白低表达促进乳腺癌细胞的异常增殖，与乳腺癌的发生密切相关。与临床病理特征的相关性研究显示，Caspase-3蛋白表达与患者淋巴结转移数相关，淋巴结转移数＞3个以上的病例的Caspase-3阳性表达率较无淋巴结转移和0～3个淋巴结转移患者明显降低；有脉管瘤栓组Caspase-3蛋白的阳性表达率低于无脉管瘤栓者；Caspase-3蛋白阴性表达的患者肿瘤长径越长，临床分期较晚，同时本研究还发现，Caspase-3蛋白的表达与P53表达呈负相关，结论与东星等［11］的研究结果一致。本实验研究结果提示，Caspase-3蛋白表达降低或缺失使浸润性乳腺癌细胞的凋亡受到抑制，增殖、凋亡失衡，从而促进乳腺癌的发生、发展；通过对Caspase-3活性测定，可能进一步了解乳腺癌发生、发展特点，对乳腺癌的诊治和预后评估具有一定的作用，但COX多因素分析显示，Caspase-3并非是浸润性乳腺癌临床预后判断的独立指标。

DIAPH-3为肌动蛋白结合蛋白，参与多种生物学过程，如细胞吞噬、微管稳定及胞质分裂等，与肌动蛋白以及Ras基因同源物的GTP酶结合，具有促进肌动蛋白聚集、刺激细胞分裂、催化激动蛋白单体成核和促进肌动蛋白丝延伸的作用。有研究表明，在肿瘤侵袭、转移和分化等病理状态下，DIAPH-3表达失调，通过与Rho激酶结合在细胞的侵袭过程中扮演重要角色［12］。在乳腺癌细胞中DIAPH-3蛋白表达下调或缺失。构建DIAPH-3稳定沉默表达载体，通过沉默DIAPH-3，发现DIAPH-3干扰后不稳定的微管蛋白生成，细胞侵袭、转移能力比沉默DIAPH-3前明显增强［13］。You等［14］在前列腺癌细胞的研究中发现，DIAPH-3沉默导致干细胞向变形细胞的转变，同时也引起癌细胞的转移、侵袭。本研究结果显示DIAPH-3表达减弱或缺失与浸润性乳腺癌患者的淋巴结转移数，是否有脉管瘤栓出现呈正相关。提示DIAPH-3表达减弱或缺失诱导浸润性乳腺癌侵袭及转移。与此同时，DIAPH-3阴性表达患者临床分期较晚，提示DIAPH-3表达减弱或缺失促进了浸润性乳腺癌的进展。Kapl an-M ei er单因素生存分析显示DIAPH-3阴性表达组患者5年生存率为84.5%，低于阳性组的95.8%（P＜0.05）。COX模型多因素生存分析发现，DIAPH-3阴性表达组患者不良预后的风险是阳性组患者的 1.687倍（95%CI=1.032，2.758），并且不依赖患者其他临床特征，可作为评估浸润性乳腺癌患者预后的独立指标。但其作用机制有待实验进一步证实。

综上所述，Caspase-3及DIAPH-3蛋白的低表达促进了浸润性乳腺癌的发生、发展，但其机制仍不十分清楚，深入探讨乳腺癌中DIAPH-3及Caspase-3的作用及机制，有望为乳腺癌的防治及预后评估提供有意义的理论依据。

［1］寇有为，王强.XIAP、Caspase-3在胃癌中表达及其相关性［J］.中国现代医学杂志，2011，21（28）:3490-3494.

［2］张黎黎，张洁，张林，等.p53、bcl-2、caspase-3在非小细胞肺癌组织中的表达及相关性分析［J］.天津医药杂志，2014，42（7）:670-673.

［3］姚文娟，宋会双，王凤琴，等.结直肠癌组织中 Caspase-3、GST-π、Pgp表达变化及意义［J］.山东医药，2014，54（47）:83-85.

［4］John K，Rösner I，Kei l hol z U，et al.Basel i ne caspase act i vi t y predi ct s progressi on f ree survi val of t em si rol i m us-t reat ed head neck cancer pat i ent s［J］.European Journal of Cancer，2015，51（12）: 1596-1602.

［5］St ast na J，Pan X，W ang H，et al.Di f f eri ng and i sof orm-speci f i c rol es f or t he f orm i ng DIAPH 3 i n pl asm a m em brane bl ebbi ng and f i l opodi a f orm at i on［J］.Cel l Res，2012，22（4）:728-745.

［6］Eng CH，H uckaba TM，Gundersen GG，et al.The f orm i n m Di a regul at es GSK3β t hrough novel PKCs t o prom ot e m i crot ubul e st abi l i zat i on but not M TOC reori ent at i on i n m i grat i ng f i brobl ast s ［J］.M ol Bi ol Cel l，2006，17（12）:5004-5016.

［7］Oberst A，Pop C，Trem bl ay AG，et al.Induci bl e di m eri zat i on and i nduci bl e cl eavage reveal a requi rem ent f or bot h processes i n Caspase-8 act i vat i on［J］.J Bi ol Chen，2010，285（22）:16632-16642.

［8］李良宏.乳腺癌中H SP90和Caspase-3的表达及其临床病理、预后的关系［J］.疑难病杂志，2012，11（4）:271-273.

［9］薛书霞，张景华，李景武，等.乳腺浸润性导管癌组织Li vi n和Caspase-3蛋白表达及其相关性研究［J］.中华肿瘤防治杂志，2011，18（23）:1855-1858.

［10］王进京，孙保存.乳腺癌中Caspase-3和Caspase-9的表达及其意义［J］.临床与实验病理学杂志，2012，28（4）:378-380.

［11］东星，李锐，于波，等.PUM A与Caspase-3表达及临床意义在乳腺癌组织中的表达及临床意义［J］.中国现代普通外科进展，2012，15（12）:940-947.

［12］H ager M H，M orl ey S，Bi el enberg DR，et al.DIAPH 3 governs t he cel l ul ar t ransi t i on t o t he am oeboi d t um our phenot ype［J］. EM BO M ol M ed，2012，4（8）:743-760.

［13］Cal vo F，Ege N，Grande-Garci a A，et al.M echano-t ransduct i on and YAP-dependent m at ri x rem odel l i ng i s requi red f or t he generat i on and m ai nt enance of cancer-associ at ed f i brobl ast s［J］.Nat Cel l Bi ol，2013，15（6）:637-646.

［14］You SY，Yang JL，Rot i ne M N，et al.NFAT5 as a t ranscri pt i onal m edi at or of m esenchym al-am oeboi d t ranst i on i nduced by DIAPH-3 l oss i n prost at e cancer［J］.The Journal of Urol ogy，2013，189（4）:209-210.

（申海菊编辑）

Role of caspase-3 and DIAPH3 in invasive breast cancer*

Ling-ling Zhang1，Ya-nan Zhang2，Cui-zhi Geng3，Yan Ding1，Hui-chai Yang1，Li Ma3，Yue-ping Liu1
（1.Department of Pathology，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang，Hebei 050011，China；2.Department of Functional Examination，the People's Hospital of Shijiazhuang，Shijiazhuang，Hebei 050011，China；3.Center of Breast Diseases，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang，Hebei 050011，China）

Objective To study the possible association of the expressions of caspase-3 and diaphanous related formin 3（DIAPH3）protein with clinicopathological features and prognosis in invasive breast cancer. Methods The expressions of caspase-3 and DIAPH3 protein in invasive breast cancer tissues from 240 cases and para-cancerous tissues from 44 cases were detected by immunohistochemical EliVision method，and then their relationships with the clinicopathological features and prognosis were analyzed.Results The positiveexpression rates of caspase-3 and DIAPH3 protein in the invasive breast cancer tissues（36.7%and 40.8% respectively）were significantly lower than those in the para-cancerous tissues（81.8%and 86.7%respectively，P＜0.05）.The expression of caspase-3 was negatively correlated with the number of lymph node metastasis，tumor size，advanced tumor clinical stage，vascular tumor embolus and positive expression of P53.The expression of DIAPH3 was also negatively correlated with the number of lymph node metastasis，vascular tumor embolusand advanced tumor clinical stage.Kaplan-Meier single factor analysis showed that the 5-year survival rates in the patients with positive expressions of caspase-3 and DIAPH3 were 95.5%and 95.8%respectively，significantly higher than those in the negative-expression patients（85.5%and 84.5%respectively）.The Cox model analysis showed that the negative expression of DIAPH3 might be a risk factor for the prognosis of invasive breast cancer（O R＾=1.687，95%CI:1.032，2.758）.Conclusions The negative expressions of caspase-3 and DIAPH3 protein are important for the development and prognosis ofinvasive breast cancer，but there is no correlation between them.The low expression of DIAPH3 is probably one of the independent factors of prognosis in breast cancer.

invasive breast cancer；caspase-3；DIAPH3；prognosis

R 737.9文献识别码：A

1005-8982（2016）05-0036-06

10.3969/j.i s s n.1005-8982.2016.05.008

2015-09-16
*

河北省自然科学基金（No：H 2015206230）

刘月平，E-m ai l：annam a@163.com，Tel：0311-89065374