牛初乳中免疫球蛋白G双抗夹心ELISA检测方法的建立

刘 金，王丽威，2，岳喜庆，*（.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 0866；2.辽宁工程技术大学理学院，辽宁 阜新 23000）



牛初乳中免疫球蛋白G双抗夹心ELISA检测方法的建立

刘 金1，王丽威1，2，岳喜庆1，*
（1.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866；2.辽宁工程技术大学理学院，辽宁 阜新 123000）

将牛免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）作为免疫原免疫BALB/c小鼠，通过细胞融合、筛选获得分泌抗牛IgG单克隆抗体的细胞株。制备小鼠腹水抗体，进一步纯化获得抗牛IgG单克隆抗体。建立双抗夹心酶联免疫吸附法检测牛初乳中IgG质量浓度，该方法在7.8～1 000 ng/mL范围内有良好的线性关系，最低检出限为7.06 ng/mL，批内变异系数为4.52%，批间变异系数为4.94%，回收率为91.85%～102.45%。此法操作简便、准确度高、稳定性好，可用于实际牛初乳样品的快速检测。

牛初乳；免疫球蛋白G；单克隆抗体；双抗夹心酶联免疫吸附法

牛初乳一般是指奶牛分娩7 d内的乳汁。牛初乳不但含有常乳中的营养物质（蛋白质、脂肪、乳糖、脂肪酸、氨基酸和矿物质），还富含多种生理活性因子，包括免疫球蛋白、乳铁蛋白、生长因子、乳过氧化氢酶和溶菌酶等［1］。其中，免疫球蛋白是最重要的一类免疫因子，牛初乳中的免疫球蛋白主要是IgG、IgM和IgA，其中IgG的含量最高，约占80%～90%［2-3］。因此，IgG含量成为衡量牛初乳及其制品质量的重要指标。目前，牛初乳中IgG检测方法主要包括免疫扩散法［1，3-6］、免疫比浊法［1，6-8］、高效液相色谱法［1，9-10］、酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法［1，11-16］和表面等离子体共振法［16］等。这些方法中免疫扩散法应用最为广泛。但此法检测时间长、精确度不高。高效液相色谱法操作繁琐，不适合大批量检测。ELISA法是近年来迅速发展的一类检测方法，其操作简便、特异性好、准确度高，适合大量样品检测，在多个领域都得到了广泛应用。在牛初乳IgG含量检测中，国外已成功开发了试剂盒，反应模式多数是竞争模式，也有夹心模式。我国在这方面起步较晚，目前主要依赖进口检测试剂盒。本研究采用单克隆抗体和多克隆抗体，建立双抗夹心ELISA法检测牛初乳中IgG含量，为牛初乳的生产加工和质量监控提供可靠的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛初乳样品为奶牛分娩3 d内所分泌的乳汁，采自辽宁辉山乳业，-20 ℃贮存。

BALB/c小鼠 白求恩医科大学动物试验中心；标准牛IgG、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、聚乙二醇、鸡卵清白蛋白、冷水鱼明胶、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体 美国Sigma公司；辣根过氧化物酶标记兔抗牛IgG多克隆抗体 博奥森公司；3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine，TMB）、96 孔酶标板、小鼠单隆抗体亚类鉴定试剂盒 鼎国昌盛生物技术公司；其他试剂纯度均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Epoch微孔板分光光度计 美国Bio-Tex公司；移液器 美国Thermo公司；Milli-Q超纯水系统 美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

包被液：0.05 mol/L碳酸盐缓冲液（pH 9.6）；缓冲液：0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（phosphatebuffered saline，PBS）（pH 7.4）、0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）；稀释液：0.01%、0.05%磷酸盐吐温缓冲液（phosphate-buffered saline with Tween-20，PBST）（0.01 mol/L PBS溶液中分别加入0.01%、0.05% Tween-20）、0.05% Tris-HCl吐温缓冲液（Tris-HCl with Tween-20，TBST）（0.05 mol/L Tris-HCl溶液加入0.05% Tween-20）；底物：TMB底物；终止液：2 mol/L H2SO4。

1.3.2 抗体的制备

选择6～8 周龄的雌性BALB/c小鼠，首次免疫时用标准牛IgG与等量弗氏完全佐剂充分乳化，腹腔注射，100 μg/只；2 周后进行二次免疫，与等量弗氏不完全佐剂充分乳化，腹腔注射，100 μg/只；二次免疫1周后尾尖采血，间接ELISA测定血清效价，血清效价达到6 000用于细胞融合。在融合前不加佐剂加强免疫，3 d后取鼠脾细胞，与sp20骨髓瘤细胞用聚乙二醇诱导融合后培养。采用间接ELISA法筛选阳性孔，克隆化培养［17］。选取效价最高的杂交瘤细胞注射于小鼠腹腔中，1 周后采集腹水，采用辛酸-硫酸铵法粗提纯后，使用Protein G亲和层析柱纯化并进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrymide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）电泳分析［18］。测定单抗亚类、蛋白质质量浓度及纯度，间接ELISA法测定纯化前后效价、抗体亲和力［18］。

1.3.3 双抗夹心法的建立

包被：用包被液将1.3.2节制备的小鼠抗牛IgG单抗稀释至一定质量浓度，每孔100 μL包被酶标板，4 ℃过夜；洗涤：弃去孔内溶液并拍打，每孔加入洗涤液200 μL后，洗板60 s，重复3 次，在每两步骤之间均需洗涤，以下同；封闭：每孔200 μL封闭剂，37 ℃孵育；加样：每孔加100 μL标准牛IgG或，37 ℃孵育；加酶标抗体：每孔加100 μL辣根过氧化物酶标兔抗牛IgG多克隆抗体（以下简称酶标抗体），37 ℃孵育，洗涤4 次；加底物显色：各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液100 μL，37 ℃暗处反应10 min；终止反应：每孔加2 mol/L硫酸50 μL，酶标仪450 nm波长条件下读取OD值。以不加牛IgG的空白孔作为阴性对照。

1.3.4 包被抗体及酶标抗体工作质量浓度的确定

采用方阵法确定单抗包被质量浓度和酶标抗体质量浓度，将纯化后单抗按500、1 000、2 000、4 000 倍稀释，包被酶标板；将酶标抗体分别稀释至2 000、4 000、8 000、10 000 倍，选取阳性值（P值）1.0～1.5之间左右为最佳质量浓度条件。

1.3.5 样品稀释液的确定

按照最优条件进行操作，将稀释液为分为3 组：a.0.01% PBST；b.0.05% PBST；c.0.05% TBST，测定OD450 nm值并计算阳性值/阴性值（P/N值），选择P/N最大值对应的稀释液作为最佳稀释液。

1.3.6 封闭剂及封闭时间的确定

分别用0.1 mol/L氯化铵溶液、1%脱脂奶粉、1% OVA、1%冷水鱼明胶作为封闭剂，计算P/N值。选择最优封闭剂；封闭时间分别在设置37℃ 30、60、90、120 min，其余步骤按照夹心ELISA法，计算P/N值。

1.3.7 抗原及酶标抗体作用时间的确定

根据已确定的条件进行操作，分别设置抗原与抗体作用时间：37 ℃ 30、45、60、90 min；酶标抗体作用时间：37 ℃ 15、30、45、60 min，计算P/N值。

1.3.8 标准曲线的建立及灵敏度

将标准牛IgG连续稀释至7.8、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1 000 ng/mL质量浓度，按优化后的双抗夹心ELISA方法，测定OD450 nm值。每个质量浓度设3 个平行。以标准品质量浓度值的对数为横坐标，OD值为纵坐标，采用Excel计算回归方程，绘制标准曲线，并根据结果计算最低检出限，即灵敏度。

1.3.9 精密度实验

采用优化后的双抗夹心ELISA方法，检测0.2 μg/mL标准牛IgG样品，同一批次选取不同孔重复10 次，计算标准差和变异系数，表示批内差异；逐批重复10 次，计算标准差和变异系数，表示批间差异。

1.3.10 加标回收率实验

取3 份同样的牛初乳样品，稀释106倍后，取1 mL，分别加入0.2 mg/mL标准牛IgG 0.5、1、2.5 μL，使终质量浓度分别为100、200、500 ng/mL，按优化后的方法测定，每个质量浓度做3 次重复，计算加标回收率。

1.3.11 实际样品检测

按优化的ELISA方法测定10 份牛初乳样品中IgG的含量。将样品稀释106倍后按优化后的方法测定后进行计算，每个样品重复3 次，结果以平均值表示。

2 结果与分析

2.1 单克隆抗体鉴定

经亚类鉴定试剂盒测定，单抗亚类为IgG1；纯化前单抗蛋白质量浓度为46.85 mg/mL，辛酸-硫酸铵法纯化后质量浓度为10.88 mg/mL，亲和层析纯化后质量浓度为2.21 mg/mL，两种方法纯化后效价均为2.56×106，将原腹水及辛酸-硫酸铵法、亲和层析两种纯化后的抗体进行SDS-PAGE电泳，结果如图1、2所示，可直接观察出纯化前腹水中杂蛋白较多，辛酸-硫酸铵法纯化后，可去除一部分杂蛋白，目的蛋白条带逐渐清晰，而亲和层析纯化法后，条带清晰，只有重链及轻链两部分，分别位于50、25 kD处，纯度较高，进一步测定亲和力常数为8.92×108L/mol。

图1 亲和层析纯化腹水Fig.1 Affinity chromatography of purified ascite

图2 腹水单抗纯化 SD S-P AG E凝胶电泳图Fig.2 SDS-PAGE gels electrophoresis of purified ascites

2.2 双抗夹心ELISA法的建立

2.2.1 包被单抗及酶标抗体质量浓度的确定

反应体系中此条件最为关键，优化方法采用方阵法，结果如表1所示，根据经验值OD值在1.0～1.5之间建立标准曲线比较合适，综合判断选择单抗稀释1 000 倍，酶标抗体稀释2 000 倍。

表1 包被单抗及酶标抗体质量浓度Table1 Coat in g c on centrati on s of McAb and diluti on of H RP-Ab

2.2.2 样品稀释液的确定

为降低空白值，提高准确性，故对稀释液进行优化，由图3可以看出，a组与b组P值相近，c组略低，但是b组与c组N值较低，且b组P/N值最大，因此确定0.05% PBST为样品稀释液。

图3 稀释液的确定Fig.3 Determination of the appropriate diluent

2.2.3 封闭剂及封闭时间的确定

在包被后，一般采用化学试剂或无关蛋白作为封闭剂，将酶标板未结合的位点进行封闭，减少非特异性吸附，提高灵敏度，本实验研究4 种封闭剂效果，结果如图4所示。由图4可以看出，0.1 mol/L氯化铵作为封闭剂时，P/N值最大，说明0.1 mol/L氯化铵封闭效果最佳。进一步研究氯化铵的封闭时间，结果如图5所示，可以看出，37 ℃、60 min为最佳封闭时间。

图4 封闭剂的确定Fig.4 Determination of sealant

图5 封闭时间的确定Fig.5 Determination of blocking time

2.2.4 抗原及酶标抗体作用时间的确定

不同反应时间其OD450 nm值相差较大，为提高灵敏度及重复性，需对抗原、酶标抗体反应时间进行优化，结果如图6所示，可以看出，抗原作用60 min时，P/N值最大，故抗原最佳作用时间为60 min；酶标抗体作用时间如图7所示，酶标抗体最佳作用时间为30 min。

图6 抗原作用时间的确定Fig.6 Determination of antigen action time

图7 酶标抗体作用时间的确定Fig.7 Determination of reaction time of enzyme linked antibody

2.2.5 标准曲线及最低检出限实验结果

牛IgG在7.8～1 000 ng/mL范围内，OD值与牛IgG质量浓度的对数值呈良好的线性关系。经计算，回归方程为y = 0.470 3 lgx-0.158 2，相关系数R2= 0.992 6。随机选择20 个孔做空白孔检测，求出平均值和变异系数s，最低检出限为平均值加3 倍变异系数（+3s），经计算最低检出限为7.06 ng/mL。

2.2.6 精密度实验结果

对200 ng/mL标准牛IgG样品分别进行批内和批间重复检测，结果如表2所示，所建立的双抗夹心ELISA法，其批内检测平均值为197 ng/mL，变异系数为4.52%；批间检测平均值为205 ng/mL，变异系数为4.94%，精密度符合要求。

表2 批内与批间的变异系数Table 2 Intra-assay and in ter-assayC Vs

2.2.7 加标回收率实验结果

以100、200、500 ng/mL三个添加量测定样品中IgG含量及回收率，结果见表3，可以看出，牛初乳样品IgG含量为53.56 ng/mL，回收率为91.85%～102.45%，在80%～120%之间均在合理范围内；变异系数为3.30%～5.32%，均在10%以下。

表3 加标回收率测定结果Table 3 Results of spiked recovery

2.2.8 实际样品检测结果

按优化的ELISA方法测定10 份样品中牛IgG的含量，结果如表4所示。由于不同奶牛个体差异，所产牛初乳中IgG含量各不相同，IgG含量为50.29～79.68 mg/mL，平均值为65.40 mg/mL。

表4 牛初乳样品中IgG含量Table 4 C on centrati on s of bov in e IgG in colostrum samples

3 讨 论

牛初乳因含有大量的免疫球蛋白而备受关注，其检测方法不断发展，其中免疫学方法已成为主要的测定方法。其中免疫扩散法最为普遍，此方法是将样品或标准牛IgG滴加于含兔抗牛IgG抗体的琼脂板小孔中，经24 h扩散后，形成肉眼沉淀环，然后测量沉淀环的直径，在一定质量浓度范围内，牛IgG的含量与沉淀环的直径呈正比，该方法操作简便，设备要求低，结果直观，但由于扩散直径的测量误差较大，导致结果准确度和灵敏度都较低，检测效率低。我国保健食品中IgG的测定采用高效亲和色谱法，主要是借助于偶联Protein A或Protein G的亲和色谱柱进行定量，线性范围为0.2～1.0 mg/mL［19］，准确度高，但操作相对繁琐。ELISA法具有特异性强、检测效率高等优点，适用于牛IgG的检测。在出口牛乳制品中IgG测定的标准中，采用间接竞争ELISA法，检测线性范围为0～51.2 mg/L［20］，可满足目前国内牛初乳制品的质量要求，但是竞争法为两种抗原竞争有限抗体，故与夹心法存在一定差别。研究表明，对于分子质量较大的蛋白物质的测定，夹心ELISA比竞争ELISA灵敏度高，而夹心ELISA测定牛IgG时，需要两种抗体，即包被抗体和酶标抗体。若都采用同一动物来源的多克隆抗体，竞争表位，反应值低；若采用不同动物来源的抗体，易产生交叉反应，使背景值高，降低了方法的灵敏度。在夹心ELISA研究开发中，获得亲和力强、特异性好的配对抗体成为首要的技术步骤。单克隆抗体与多克隆抗体相比，具一定的优越性，具有特异性强、效价高、重复性好等优点。本研究制备特异性强的单克隆抗体，经纯化后纯度高，效价为2.56×106，亲和力常数为3.9×108L/mol，在107～1012范围内，属高亲和力抗体。另外，由于测定目标物质为牛初乳中IgG，封闭剂分为化学试剂或无关蛋白，在包被酶标板后，对酶标板未结合的位点进行封闭，减少非特异性结合，相对于化学试剂，蛋白试剂储存效果不好，而一般市面蛋白封闭剂，例如牛血清白蛋白等蛋白试剂可能残留IgG，如果采用进口试剂，成本较高，且实验结果显示氯化铵溶液封闭效果较好。

在此基础上，对ELISA反应体系中的抗体质量浓度、稀释液、封闭条件及反应时间等进行了优化，并对方法的准确性、精确性和适用性进行了评价。优化后的ELISA方法为：将单抗稀释1 000 倍在4 ℃过夜包被后，加0.1 mol/L氯化铵37 ℃封闭60 min，加样品后37 ℃反应60 min，加入2 000 倍稀释的酶标兔抗牛抗体后37 ℃反应30 min，最后加底物显色测值，此法回归方程为y= 0.470 3 lgx-0.158 2，R2= 0.992 6，在7.8～1 000 ng/mL范围内有良好的线性相关，最低检出限能达到7.06 ng/mL，加标回收率平均值为95.87%，变异系数低于10%，稳定性好。在实际检测中，奶牛在分娩后第一次分泌的乳汁牛初乳IgG最高，含量为50～100 mg/mL，然后将快速下降，1～2周后其含量基本与常乳一致［21-23］，采用此研究方法分别检测10份牛初乳样品，IgG含量在为50.29～79.68 mg/mL。奶牛虽存在个体差异，但此牛场奶牛分娩3 d内所分泌的初乳能满足初乳制品加工要求。综合结果，本研究利用所获抗体，建立了双抗夹心ELISA方法，操作简便，结果灵敏度高、准确性好、重复性强，可用于牛初乳中IgG的检测。

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Development of Double Antibody Sandwich ELISA for Detection of Bovine Colostrum Immunoglobulin G

LIU Jin1， WANG Liwei1，2， YUE Xiqing1，*
（1.College of Food Science， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China；2.College of Science， Liaoning Technology University， Fuxin 123000， China）

The hybridoma cells secreting monoclonal antibody （McAb） against bovine colostrum immunoglobulin G （IgG）were developed by cell fusion technology after immunization of BALB/c mice with bovine IgG.McAbs were obtained by purification of mouse ascites.A double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） technique was established for the detection of bovine colostrum IgG.The linear range was 7.8-1 000 ng/mL and the limit of detection （LOD）was 7.06 ng/mL.The intra-assay and inter-assay coefficient of variations were 4.52% and 4.94%， respectively.The recovery rate was 91.85%-102.45%.The ELISA method can provide a simple， accurate and stabile approach for the rapid detection of bovine colostrum IgG.

bovine colostrum； immunoglobulin G （IgG）； monoclonal antibody； sandwich ELISA

10.7506/spkx1002-6630-201614013

TS252.7

A

1002-6630（2016）14-0074-06

刘金， 王丽威， 岳喜庆.牛初乳中免疫球蛋白G双抗夹心ELISA检测方法的建立［J］.食品科学， 2016， 37（14）: 74-79.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614013. http://www.spkx.net.cn

LIU Jin， WANG Liwei， YUE Xiqing.Development of double antibody sandwich elisa for detection of bovine colostrum immunoglobulin G［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 74-79.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614013. http://www.spkx.net.cn

2015-10-03

2011年度国家星火计划项目（2011GA650001）

刘金（1991—），女，硕士研究生，研究方向为动物性产品加工。E-mail：liujin911216@163.com

*通信作者：岳喜庆（1966—），男，教授，博士，研究方向为动物性产品加工。E-mail：yxqsyau@126.com