斑节对虾泛素融合蛋白UbL40基因的克隆及表达分析

傅明骏，吴 松，唐 蕾，周发林，邱丽华，江世贵

（1.中国水产科学研究院南海水产研究所/农业部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东 广州 510300；2.中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心，海南 三亚 572028；3.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；4.华南农业大学动物科学学院，广东 广州 510642）

斑节对虾泛素融合蛋白UbL40基因的克隆及表达分析

傅明骏1，2，吴 松1，3，唐 蕾1，4，周发林1，邱丽华1，江世贵1

（1.中国水产科学研究院南海水产研究所/农业部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东 广州 510300；2.中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心，海南 三亚 572028；3.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；4.华南农业大学动物科学学院，广东 广州 510642）

傅明骏，吴松，唐蕾，等.斑节对虾泛素融合蛋白UbL40基因的克隆及表达分析［J］.广东农业科学，2016，43（4）：144-150.

从斑节对虾（Penaeus monodon）肝胰腺转录组数据中筛选获得泛素融合蛋白UbL40基因（ubiquitin/ribosomal L40 fusion protein，PmUbL40）的部分序列，利用RACE技术克隆其cDNA全长序列，通过生物信息学进行结构分析；利用实时定量PCR技术检测该基因在斑节对虾不同组织及卵巢不同发育期的表达情况。结果表明，PmUbL40基因cDNA全长571 bp，开放阅读框（Open reading frame，ORF）长390 bp，编码129个氨基酸，预测分子量约14.7 ku，理论等电点为9.76。预测氨基酸序列的N-末端（1～76aa）为高度保守的泛素结构域，C-末端（77～129aa）为典型的核糖体蛋白L40结构域。多重序列比对表明不同物种的UbL40在进化过程中高度保守。实时定量PCR结果显示PmUbL40基因在肝胰腺的表达量最高，肌肉、卵巢次之，其他组织的表达较低；在卵巢发育过程中PmUbL40基因在II期表达最高，其次是V期，显著高于I、III、IV期。研究结果表明PmUbL40基因在斑节对虾卵巢发育过程中可能具有重要作用。

斑节对虾；泛素融合蛋白L40；卵巢发育；基因克隆

泛素-蛋白酶体途径（UPP）是生物体内一种ATP依赖性的蛋白降解途径，由泛素（ubiquitin，Ub）、泛素活化酶（ubiquitin-activating enzyme，E1）、泛素结合酶（ubiquitin-conjugating enzymes，E2s）、泛素-蛋白连接酶（ubiquitin-protein ligases，E3s）、26 S蛋白酶体等组成，通过级联反应降解蛋白，是一种重要的蛋白降解方式。UPP途径在机体的许多生理功能中起重要作用，如细胞周期调控、细胞凋亡、转录调控、信号转导、DNA 损伤和修复和免疫应答等［1-4］。研究表明，UPP 途径参与雄性生殖系统的精子发生、精子成熟和受精等生理活动，同时在雌性的妊娠早期和正常月经周期子宫内膜的组织重建、卵母细胞减数分裂成熟和早期胚胎发育、甾体激素受体的代谢等生理活动中均具有重要作用［5-6］。在配子发生这个复杂的生理过程中，尤其是减数分裂和配子成熟，UPP途径参与了蛋白的降解来确保整个生理过程有序进行。泛素Ub在卵母细胞第一次减数次分裂和第二次减数分裂过程中，参与细胞周期蛋白及其他细胞蛋白的降解［6-7］；在性腺发育及配子的发生过程中具有重要作用。Ub是真核生物广泛存的一种球状蛋白，仅由76个氨基酸组成，通过标记目标蛋白进入蛋白酶体后被特异性降解。泛素基因可分为两类，一种是以重复基因首尾相连方式形成的聚泛素基因，编码多聚泛素后被特异的水解酶水解成单个泛素蛋白；另一种是泛素单体和核糖体形成的融合蛋白，在泛素C末端连接52个或76～81个氨基酸延伸部分，52个氨基酸是核糖体60S亚基组分，与核糖体L40有很高的同源性；76～81个氨基酸是核糖体40S亚基的组分，与核糖体S27具有很高的同源性。这两种蛋白被称为泛素融合蛋白L40 （UbL40）或泛素融合蛋白S27（UbS27）［8］。

斑节对虾（Penaeus monodon）作为世界上最主要的对虾养殖品种之一，因其高营养价值和经济价值备受人们关注。斑节对虾在卵巢组织学、性成熟指数（GSI）、卵细胞直径、卵核的大小和形状、核仁的形态和分布、不同发育阶段卵细胞数量比例等方面将其卵巢周期划分为6个时期，即卵原细胞期（Ⅰ）、卵母细胞减数分裂前期的前卵黄生成期（Ⅱ）、初级卵黄生成期（Ⅲ）、次级卵黄生成期（Ⅳ）、成熟期（Ⅴ）和产后期（Ⅵ）［9-10］。目前，在人工调控斑节对虾性腺发育方面主要依赖于切除眼柄来诱导卵巢发育。但是切除眼柄技术仍然存在许多问题，亲虾对病害易感，死亡率升高，眼柄切除亲虾产的卵孵化率不高或延迟，对后代产量产生影响。因此，从分子水平认识斑节对虾卵巢发育的作用机制，探讨其卵巢发育调控机理，指导发展新的人工催熟技术，是当前研究的重点。本研究通过研究泛素融合蛋白UbL40基因（PmUbL40）克隆分析及其在斑节对虾各组织和卵巢发育过程中的表达情况，为进一步探明斑节对虾卵巢的分子发育机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 斑节对虾 从海南三亚海域收集不同发育阶段的雌性斑节对虾并暂养3 d。通过观察斑节对虾的颜色、外部形态和性腺颜色来初步确定对虾的发育阶段期，斑节对虾不同发育期各3只取卵巢组织后立即液氮冻存，部分卵巢组织用 4%多聚甲醛保存用于切片制作已确认卵巢发育时期分期［10］。

1.1.2 主要试剂 RNAlater、Trizol（Life Technologies公司），PrimeScriptRTReagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒、pMD18-T 载体、ExTaq酶、SYBR®Premix EX TaqTM（Perfect Real Time） 试剂盒、SMARTTMRACE cDNA kit（TaKaRa 公司）、琼脂糖凝胶回收试剂盒（上海生工公司）。

1.1.3 引物 根据从斑节对虾转录组数据中得到的PmUbL40基因片段，设计特异性引物，PmUbL40基因RACE引物（3'Race-F1：GGCTCAATTACACCACCACGCAG和3' Race-F2：TGCAGTTGTACTTTTCAGCCAAA AGC），PmUbL40基因开放阅读框验证引物（PmUbL40-F：TGTTTTGGGAAGAGGGAT和PmUbL40-R：CAAGACATTTAATACATGGTCC）；并设计PmUbL40基因定量引物（PmUbL40-qF：TTTGGCTGAAAAGTACAACTGCA和PmUbL40-qR：AGCTTCTTCTTGGGTCGGAT）和 E F 1 α 基因定量引物（E F 1 α-q F：TTCCGACTCCAAGAACGACC和EF1α-qR：GAGCAGTGTGGCAATCAAGC）

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA提取及cDNA合成 根据Trizol说明书提取斑节对虾各组织（脑神经、胸神经、血淋巴、肌肉、肠道、心脏、肝胰腺和卵巢）及不同发育时期的卵巢组织总RNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性，核酸微量定量仪NanoDrop-2000检测A260/A280比值和浓度，按cDNA合成试剂盒说明进行反转录，反转录产物-20℃保存备用。

1.2.2 SMART-RACE克隆基因cDNA全长 根据实验室已有的转录组数据筛选出目的PmUbL40基因片段，运用SMART-RACE方法，扩增得到PmUbL40基因cDNA序列全长。然后通过OFR Finder找的可能开放阅读框（OFR），并用开放阅读框验证引物扩增验证确定该基因OFR的正确性。

1.2.3 生物信息学分析 利用NCBI数据库中的Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）、OFR Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/orfig.cgi）等在线软件对测序结果进行分析，验证该目的基因并将其拼接得到该基因的全长cDNA序列；SingnalP3.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）查找可能的信号肽序列；使用（http：//cn.expasy.org/tools/pi_tool.html）预测基因的等电点及分子量；使用 NetPhos 2.0 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）预测磷酸化位点；使用SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/）预测其蛋白结构域；使用 PSORT II Prediction（http：//psort.hgc.jp/form2.html）进行细胞定位的预测；利用MatGAT2.02（http：//ww3.bergen.edu/faculty/jsmalley/matgat.html）进行序列相似性和一致性分析；利用BioEdit（http：//www.mbio.ncsu.edu/bioedit/）软件进行多重比对；利用Mega5.0 软件（http：//www.megasoftware.net/）中的邻位相连法（Neighbor-joining）构建系统进化树（Bootstrap=1 000）。

1.2.4 PmUbLL40基因在各组织及卵巢不同发育时期的表达分析 根据cDNA全长序列设计实时荧光定量PCR引物PmUbL40-qF和PmUbL40-qR及内参引物EF1α-qF和EF1α-qR。Real time-PCR的反应体系为：20 μL体系中含10 μL SYBR Green I Real time PCR mix，10 μmol/L的引物F和引物R 各0.4 μL，2 μL cDNA第一链，用灭菌水补足，每个样品cDNA及内参分别做3个重复。反应条件为95℃ 1 min；95℃ 15 s、60℃ 1 min，45个循环。检测PmUbL40和EF1α基因的溶解曲线和扩增曲线。根据仪器分析得出各个样品的CT值，通过计算获得每个样品的RQ值即 2-△△CT，其中△CT=各样品目的基因的 CT值-内参基因Ef1α的 CT值，△△CT=每一个样品的△CT值-基准样品的△CT值，基因表达水平由 RQ平均值±标准差（mean±SD）来表示，SPSS 18.0软件对数据进行样本单因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 PmUbL40基因全长及cDNA序列分析

根据已知的斑节对虾肝胰腺转录组序列，利用RACE克隆得到斑节对虾PmUbL40基因cDNA全长序列571 bp（GenBank登录号：KP641180），包括50 bp的5'UTR、131 bp的3'UTR，开放阅读框（ORF）为390 bp，编码129个氨基酸（图1），预测蛋白的相对分子质量为14.7 ku，等电点为9.76。SingnalP分析其预测氨基酸序列不含有信号肽序列。使用SMART预测氨基酸序列的氮末端（1～76aa）为高度保守的泛素结构域，碳末端（77～129aa）为典型的核糖体蛋白L40结构域。NetPhos 2.0 Server对其氨基酸序列进行分析得到以下可能的磷酸化位点：1个苏氨酸磷酸化位点（T22），2个丝氨酸磷酸化位点（S57和S108），1个酪氨酸磷酸化位点（Y89）。PSORT Ⅱ预测结果显示其细胞定位在细胞核内（60.9%）。核糖体蛋白L40结构域中含有4个半胱氨酸残基（C96、C99、C110、C115）构成1个C2-C2型锌指结构，1个核定位序列（109NCRKKKCGH117）。

2.3 PmUbL40与其他物种UbL40序列比对及系统进化树分析

利用MatGAT2.02将 PmUbL40的蛋白序列与GenBank数据库中其他物种的蛋白序列进行序列相似性和一致性分析，并用Bioedit进行多重序列比对，结果（图2）显示，PmUbL40在物种进化中高度保守，斑节对虾与凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei，GenBank登录号：AIJ28479）的UbL40蛋白序列相似性和一致性均达100%。

利用MEGA5.0软件构建PmUbL40和其他物种 U b的系统进化树，结果（图3）表明，PmUbL40与凡纳滨对虾、中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis，ADF45323）、丰年虾（Artemia franciscana，ABS19964）聚为一支，亲缘关系较近；脊椎动物人类（Homo sapiens，NP_003324）、牦牛（Bos mutus，ELR54587）、斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus，NP_001187064）、鲤鱼（Cyprinus carpio，ABS32204）、斑马鱼（Danio rerio，NP_001032190）和大西洋鲑（Salmo salar，ACN09942）聚为一支；软体动物牡蛎（Crassostrea gigas，EKC19428）、光滑双脐螺（Biomphalaria glabrata，AAG49552）聚为一支；海参（Holothuria glaberrima，AEB53190）和鹿角珊瑚（Acropora millepora，AAC47388）聚为一支。

图1 PmUbL40全长 cDNA 序列及其推导的氨基酸序列

图2 斑节对虾PmUbL40与其他物种的Ub蛋白氨基酸序列比对

图3 PmUbL40与其他物种UbL40氨基酸序列系统进化树

2.4 PmUbL40基因在不同组织中的表达

利用实时荧光定量PCR检测PmUbL40在不同组织中的表达情况，结果（图4）显示，PmUbL40在各组织中肝胰腺表达量最高，其次为肌肉和卵巢，其中肝胰腺与其他个组织表达差异显著。

图4 PmUbL40基因在不同组织中的表达

2.5 PmUbL40基因在卵巢不同发育时期的表达

斑节对虾卵巢发育各期中，PmUbL40在卵巢Ⅱ期的表达量最高，显著高于其他期卵巢；其次为Ⅴ期，显著高于卵巢I、III、IV期的表达量（图5）。

图5 PmUbL40基因在卵巢不同发育时期的表达

3 　讨论

UPP途径是生物体内重要的蛋白降解途径，是一个复杂、严密调控的过程，由Ub、E1、E2s、E3s、26S蛋白酶体等组分间的级联反应来降解蛋白的一种方式。本研究以斑节对虾转录组数据库中筛选获得泛素融合蛋白L40（PmUbL40）基因片段，通过RACE方法克隆得到了PmUbL40的cDNA全长序列，预测氨基酸序列含有1个高度保守的泛素结构域和核糖体蛋白L40结构域，并含有1个C2-C2型锌指结构和1个核定位序列。序列比对结果发现，各物种间UbL40氨基酸序列的相似性均达90%以上，表明各物种UbL40序列在进化过程中高度保守。通过对PmUbL40氨基酸序列的磷酸化位点的预测，该蛋白存在1个苏氨酸磷酸化位点（T22）、2个丝氨酸磷酸化位点（S57和S108）、1个酪氨酸磷酸化位点（Y89），磷酸化位点作为信号传导等调控分子的重要结构，可以预测PmUbL40在细胞增殖和细胞周期中起到广泛的调控作用。PmUbL40蛋白由泛素结构域和核糖体蛋白L40结构域两部分组成，核糖体蛋白L40结构域参与核糖体60S大亚基的组装，形式分子伴侣的功能。在这过程中，由特殊的肽链内切酶识别泛素结构域和核糖体蛋白L40结构域之间的酶切位点，将核糖体蛋白L40结构域切下，释放出泛素结构域进入UPP途径形式功能。

PmUbL40基因在斑节对虾各组织的表达定量结果中显示，在肝胰腺中表达量显著高于其他各组织，其次为肌肉和卵巢，研究表明甲壳动物的肝胰腺是营养物质消化和储存的重要器官，与甲壳动物的生长发育和生殖具有密切关系［11］，结果暗示了PmUbL40可能对于斑节对虾的蛋白分解与利用具有一定作用。

本研究对斑节对虾卵巢发育不同时期中PmUbL40的表达结果显示，卵巢发育Ⅱ期显著高于其他各期，其次为Ⅴ期，显著高于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ期。斑节对虾卵巢发育过程主要包括卵子的形成和卵黄积累的过程。细胞周期在细胞分裂和配子形成过程中具有重要作用［12-13］，而在细胞周期过程中，各个发育时期的过度需要细胞周期蛋白激活并在下一个发育时期降解以便于细胞周期的正常进行，细胞内80%以上蛋白质包括大多数的周期蛋白是通过UPP降解的［14］。卵巢发育Ⅰ期是卵原细胞期，主要以有丝分裂为主的卵原细胞的增殖，而此期PmUbL40基因表达相对较低，说明该基因可能较少参与前期的细胞有丝分裂过程。卵巢发育Ⅱ期开始卵原细胞的减数分裂以及卵黄合成的前期准备，而此期PmUbL40大量表达，说明PmUbL40可能参与卵巢发育减数分裂过程，以及可能对卵黄蛋白的形成起到调节作用。随着卵巢发育的逐步成熟，卵巢发育即将开始一个新的周期，此时成熟期（即发育Ⅴ期）卵巢PmUbL40表达较为升高。

UPP途径中对甲壳动物的性腺发育和配子发生具有重要作用，Zhang 等［15］在日本沼虾中克隆了Ubc9基因，通过实时定量PCR检测了Ubc9基因的表达情况，结果显示Ubc9基因在卵巢发育早期表达较低，卵黄粒期时达到最大，而成熟期降至最低值，表明Ubc9基因可能在卵子发生过程中扮演着重要角色。戴燕彬等［16］筛选出泛素基因（Ubquitin）片段，其cDNA 序列全长555 bp， 并对其结构进行分析，利用实时定量 PCR 技术检测发现，Ub 在鳃中的表达水平最高，卵巢次之，各组织间的表达无显著性差异，Ub在卵巢发育O5 期的表达水平最高，O1、O4 期次之，O2 期表达量最低且与 O5 期具有显著差异，Ub在精巢发育T2 期的表达量最高，其次为 T1 期，T3 期表达最低且与 T2期具有显著差异，表明Ub对于拟穴青蟹生殖细胞的发育可能具有重要作用。Wang等［17］利用RTPCR检测了中华绒螯蟹EsSUMO-1 和EsUbc9基因分别在精巢和卵巢中的表达情况，结果EsSUMO-1 和EsUbc9基因在精巢Ⅱ-1阶段表达适中，在Ⅱ-2阶段增多，然后逐渐下降；在卵巢中，早期EsSUMO-1 和EsUbc9基因表达低，在Ⅲ-2阶段表达量达到最大，在Ⅳ期逐渐降低，表明在中华绒螯蟹精卵子发生过程中EsSUMO-1 和EsUbc9基因可能具有重要作用。Shen等［18］采用退火控制引物技术从日本囊对虾性腺中筛选出泛素缀合酶E2r基因并证明其在精巢中的表达水平高于卵巢，在精巢T2期的表达水平达到最高，而在卵巢O1表达最低，在卵巢O4和O5的表达值相近。Leelatanawit等［19］在斑节对虾精巢cDNA文库中找到许多精巢发育相关基因，如SUMO-1、泛素缀合酶E2等。Preechaphol等［20］在斑节对虾卵巢EST文库中找到X染色体泛素特异性蛋白酶（ubiquitin-specific protease，X-linked，Usp9x），并对该基因在精卵巢不同发育时期中的表达进行研究，结果表明该基因在O5期表达水平达到最高值，而在精巢中T2期表达量最高，可能是精巢中大量生精细胞处于快速增殖期。本研究中，PmUbL40基因卵巢发育Ⅱ期的表达量最高，可能参与了卵巢组织中的卵母细胞的快速增殖。

综上所述，本研究克隆了斑节对虾PmUbL40基因的全长cDNA序列并对基因序列，研究了PmUbL40基因在不同组织和卵巢发育不同时期的表达特征，为研究PmUbL40在斑节对虾卵巢发育和卵子发生可能具有重要作用奠定基础。

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（责任编辑 崔建勋）

Molecular characterization and expression profiles of UbS27 gene from black tiger shrimp （Penaeus monodon）

FU Ming-jun1，2，WU Song1，3，TANG Lei1，4，ZHOU Fa-lin1，QIU Li-hua1，JIANG Shi-gui1
（1.South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences/Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization，Ministry of Agriculture，Guangzhou 510300，China；2.Tropical Aquaculture Research and Development Center of South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Sanya 572018，China 3.College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；4.College of Animal Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

Penaeus monodon ubiquitin/ribosomal L40 fusion protein gene （PmUbL40） was identified and characterized by using an approach which combines the data of transcriptome and rapid amplification of cDNA end （RACE）.The expression profile of PmUbL40 in different development stages of the ovary and various tissues were determined by real-time quantitative PCR.The full length cDNA of PmUbL40 gene was of 390bp，which encoded a protein of 129 amino acids with estimated molecular mass of 14.7 ku and theoretical isoelectric point of 9.76.The encoded protein consists ubiquitin domain （1-76aa）and ribosomal L40 domain （77-129aa）.Real-time quantitative PCR results showed that PmUbL40 was expressed high in hepatopancreas than in other tissues.And PmUbL40 was expressed the highest in the ovary stay II，and than in ovary stage V，which indicated that PmUbL40 may play an important role in ovary development and oogenesis.

Penaeus monodon；ubiquitin/ribosomal L40 fusion protein （UbL40）；ovary development；gene cloning

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.04.027

2015-04-04

国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-47）；广东省科技计划项目（2013B040402016，2014A020208039）；海南省自然科学基金（20163147）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（2014TS12）

傅明骏（1983-），男，博士，助理研究员，E-mail：fu.mj@163.com

江世贵（1964-），男，博士，研究员，E-mail：jiangsg@21cn.com

S917；Q786

A

1004-874X（2016）04-0144-07