电刺激迷走神经和甲基泼尼松龙对兔脊髓损伤后TNF-α水平的影响*

潘　宏，王凌志，陶岳峰，江　兵，曹燕庆，郑　毅，章小军

(安徽医科大学附属安庆医院整形外科，安徽安庆 246003)



电刺激迷走神经和甲基泼尼松龙对兔脊髓损伤后TNF-α水平的影响*

潘宏，王凌志，陶岳峰，江兵，曹燕庆，郑毅，章小军

(安徽医科大学附属安庆医院整形外科，安徽安庆 246003)

[摘要]目的探讨迷走神经刺激对兔脊髓损伤(SCI)后脊髓组织中肿瘤坏死因子-α (TNF-α)水平的影响，并与甲基泼尼松龙(MP)进行比较。方法125只新西兰大白兔分为假手术组(SHAM组，25只)、SCI组(25只)、迷走神经刺激组(STM组，25只)、MP组(25只)和STM+MP组(25只)。采用改良Allen 打击法制作兔脊髓损伤模型，STM组及STM+MP组于脊髓损伤后接受右侧颈迷走神经电刺激(5 V、2 ms和1 Hz，持续20 min)。术后1、4、8、12、24 h分别采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法及逆转录PCR(RT-PCR)法检测各组脊髓组织中TNF-α蛋白水平及mRNA水平。结果与SCI组相比，STM组、MP组、STM+MP组的脊髓组织中TNF-α蛋白水平均有明显下降，其中STM+MP组降低最为显著；与SCI组和STM组相比较，在各个时间点MP组和STM+MP组的TNF-α mRNA水平下降明显。结论迷走神经刺激可降低兔急性脊髓损伤的促炎因子TNF-α蛋白水平，其效果接近于MP，且在抑制TNF-α蛋白表达方面与MP具有协同作用。

[关键词]脊髓损伤；肿瘤坏死因子-α；甲基泼尼松龙；迷走神经刺激

目前，全球的脊髓损伤(spinal cord injury，SCI) 的发病率约为14.5/10万～57.8/10万[1]，SCI在我国也属于高发疾病，具有较高的致残率和病死率。SCI的损伤机制包括各种致伤因素造成的原发性损伤，以及随之而来的继发性损伤。继发性损伤可以破坏中枢神经系统(central nervous system，CNS)的血脑屏障，导致脊髓组织出血、水肿，免疫细胞和抗体可以通过受损的血脑屏障侵入CNS，损伤局部而引起剧烈的免疫炎性反应。炎性反应是促使脊髓神经细胞发生变性坏死的重要环节,而介导炎性反应发生和发展的是一些重要的细胞因子，其中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在SCI中的作用逐渐受到重视。TNF-α不仅可以对脊髓组织造成直接损害，还可以启动和上调多种炎症介质及细胞因子，诱发炎性反应的级联放大效应,进一步加重继发性损伤[2]。近年来有研究发现,刺激外周迷走神经能够显著和快速地抑制TNF-α的释放,减轻全身及局部的炎性反应，从而提出了胆碱能抗炎通路 (cholinergic anti-inflammatory pathway,CAP)的理论[3]。本实验拟在兔SCI模型基础上，观察和比较电刺激迷走神经及甲基泼尼松龙(methylprednisolone，MP)对兔SCI后炎症性细胞因子TNF-α的影响作用，为治疗SCI提供新的思路。

1材料与方法

1.1材料125只新西兰大白兔，体质量(2.4±0.2)kg，购自上海杰思捷实验动物有限公司。分为5组：假手术组(SHAM组，25只)、SCI组(25只)、迷走神经电刺激组(STM组，25只)、MP组(25只)、STM+MP组(25只)。

1.2方法

1.2.1SCI模型制作新西兰兔以3%的戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉，剂量约30 mg/kg(即1 mL/kg)。常规备皮、消毒，取俯卧位，行背部后正中切口，逐层切开。依据体表定位(确定第12肋)，分离并显露T11～L2棘突，小心咬除T12～L1棘突及椎板，显露相应节段脊髓组织，注意不伤及硬膜囊。采用改良Allen打击法建立兔SCI模型，用造模器自带夹持器扣住T11和L2棘突，以固定脊柱，使用自制的打击装置打击致伤脊髓组织，硬脊膜完好无破损。新西兰兔双后肢成软瘫，刺激无反应后，逐层关闭切口。伤口撒以抗生素。

1.2.2实验过程及样本采集(1)SHAM组仅行椎板切除，不损伤脊髓，仅暴露双侧迷走神经，无其他特殊处理；(2)SCI组采用改良Allen打击法建立SCI模型；(3)STM组对SCI模型先行双侧迷走神经暴露并予以切断，SCI后即刻采用电刺激治疗仪(G6805-Ⅱ型，青岛)予以右侧迷走神经远端持续电刺激(5 V、2 ms和1 Hz) 20 min[4]；(4)MP组对SCI模型即刻予以MP冲击治疗(给予15 min内静脉滴注30 mg/kg MP)，无后续特殊处理[5]；(5)STM+MP组对SCI模型即刻予以右侧迷走神经远端持续电刺激(5 V、2 ms和1 Hz) 20 min，并同时给予MP冲击治疗(予以15 min内静脉滴注30 mg/kg MP)。SHAM组、SCI组、STM组、MP组、STM+MP组分别于术后1、4、8、12、24 h各个时间点各处死5只新西兰兔并取材。取材时以伤段为中心取邻近两端的脊髓组织，长约1.5 cm，称质量后均分为两部分，一部分进行酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测TNF-α水平，另一部分进行TNF-α mRNA测定。所取脊髓组织均迅速浸入液氮5 min后转移到-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.3逆转录PCR(RT-PCR)检测TNF-α mRNA表达取-80 ℃保存的脊髓组织标本，严格按照Trizol说明书提取脊髓组织总RNA。提取的总RNA经高精度分光光度计(Merinton SMA4000，美国)检测合格后进行逆转录实验。按照逆转录试剂盒 (MBI Fermentas，立陶宛) 说明书完成实验并保留cDNA，在进行PCR实验之前根据RNA浓度将cDNA稀释成一致水平。应用Primer Premier 6.0设计PCR引物，由上海博亚公司合成。兔TNF-α引物序列上游5′-TCT TCT GCC TGC TGC ACT TC-3′，下游5′-CTT GCG GGT TTG CTA CTA CG-3′；兔三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物序列为上游5′-AGA GCA CCA GAG GAG GAC GA-3′，下游5′-TGG GAT GGA AAC TGT GAA GAG G-3′。RT-PCR的步骤和条件按试剂盒(TianGen，北京)及定量PCR仪(BIO-RAD CFX，美国)的操作说明书进行。实验结果由荧光定量PCR分析软件BIO-RAD CFX Manager自动进行统计和计算。

1.2.4ELISA检测TNF-α蛋白表达取-80 ℃保存的脊髓组织于冰上解冻，以每克组织加入1 mL裂解液冰浴超声匀浆，匀浆后低温离心，取提取的上清液及不同浓度的标准品各孔100 μL，按照TNF-α ELISA试剂盒(Cloud-Clone Corp，美国)说明书操作，用酶标仪(Spectra Plus 384，美国)在450 μm测定光密度(OD)值。

1.2.5TNF-α表达的Western Blot 测定取出液氮中冻存的标本,将组织块剪碎,加入冰预冷的细胞裂解液进行匀浆，4 ℃，12 000 r/min离心10 min，取上清液，采用蛋白质定量试剂盒(BCA)法测定蛋白浓度。配制10%分离胶和5%浓缩胶，上样，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳。根据蛋白Marker的位置切胶，将聚偏二氯乙烯(PVDF)膜和滤纸剪成与需印迹凝胶相似的小块。随后，先将PVDF膜在甲醇中浸泡约30 s，再在转移缓冲液中浸泡10 min，后与滤纸、凝胶一起放入电转移缓冲液中。按夹心法依次将滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸叠放于转膜板上夹紧，插入电泳槽中，倒入转膜缓冲液，100 mA稳流电转移2～3 h；取出PVDF膜，去离子水洗涤，将PVDF膜浸入含5%脱脂奶粉的封闭液中，置摇床上缓慢摇动，室温封闭1 h；取出已封闭的PVDF膜，浸于TBST缓冲液中，于摇床上缓慢洗涤5 min。然后，加入一抗，4 ℃孵育过夜；弃去一抗，TBST缓冲液漂洗3遍，每次15 min；加入二抗，于室温摇床上孵育2 h；弃去二抗，TBST缓冲液漂洗3遍，每次15 min；电化学发光(ECL)发光液发光。凝胶成像系统采集及分析(ChemiDoc XRS+System，美国)。

2结果

2.1各组脊髓组织中TNF-α的ELISA检测结果正常脊髓组织中TNF-α少量表达，SCI后其表达迅速上调，于12 h达到高峰后开始下降；MP组、STM组与SCI组相比，伤后各个时间段TNF-α的蛋白水平均受到不同程度的抑制，差异均有统计学意义(P<0.01)；MP组和STM组相比，于伤后8 h和24 h的TNF-α蛋白水平差异有统计学意义(P<0.01)；STM+MP组伤后1、4、8、12、24 h 5个时间点TNF-α蛋白水平均低于MP组和STM组(P<0.01)；SHAM组术后TNF-α蛋白水平低，与其他组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见图1、表1。

图1　各组脊髓组织中 TNF-α蛋白水平

组别n术后1h术后4h术后8h术后12h术后24hSCI组25874.29±57.631124.06±63.201390.09±70.541598.51±83.621327.35±67.28STM组25434.17±34.28a633.34±47.35a984.25±56.74a1117.37±58.93a1078.55±61.86a

续表1　各组TNF-α蛋白水平的变化

a：P<0.01,与SCI组比较;b：P<0.01,与STM组比较;c：P<0.01,与MP组比较;d：P<0.01,与STM+MP组比较。

2.2各组脊髓组织中TNF-α的Western blot检测结果SHAM组脊髓组织中TNF-α仅有少量表达，SCI后24 h时脊髓组织中TNF-α的表达明显升高，经迷走神经刺激或(和)MP冲击治疗，脊髓组织中的TNF-α的表达均有下降,见图2。

图2　SCI后24 h时TNF-α的表达情况

2.3脊髓组织中TNF-α mRNA的变化SCI后，TNF-α mRNA水平在1 h内迅速达到高峰，然后逐步下降；STM组和SCI组相比，各个时间点的TNF-α mRNA水平均差异无统计学意义(P>0.05)；与SCI组和STM组相比较，MP组和STM+MP组的TNF-α mRNA水平下降明显，各个时间点的差异均有统计学意义(P<0.05)；MP组和STM+MP组相比，于术后各时间点的TNF-α mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05)；SHAM组术后TNF-α mRNA水平低，与其他组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见图3、表2。

图3　各组脊髓组织中TNF-α mRNA水平

组别n术后1h术后4h术后8h术后12h术后24hSCI组250.933±0.0530.912±0.0640.867±0.0680.819±0.0670.775±0.069STM组250.927±0.0510.884±0.0580.892±0.0540.800±0.0570.759±0.058MP组250.659±0.071ab0.610±0.067ab0.542±0.062ab0.509±0.054ab0.449±0.057abSTM+MP组250.635±0.057ab0.632±0.052ab0.521±0.049ab0.485±0.040ab0.465±0.038abSHAM组250.137±0.0215abcd0.142±0.0224abcd0.144±0.0192abcd0.140±0.0209abcd0.142±0.0213abcdF184.68156.99164.03165.15128.12P<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

a：P<0.01,与SCI组比较;b：P<0.01,与STM组比较;c：P<0.01,与MP组比较;d：P<0.01,与STM+MP组比较。

3讨论

SCI的病理生理过程包括原发性损伤和继发性损伤两个阶段，原发性机械损伤是不可逆的，而继发性SCI是一个可以在细胞和分子水平主动调节的过程，具有可逆性而且可以被控制[2]。多种细胞因子在SCI后早期即可明显上调，诱导和参与损伤局部的炎性反应，在继发性损伤的病理过程中起着重要作用[1]，其中TNF-α是起关键作用的一组细胞因子[6]。有研究发现，在SCI后1 h损伤部位的TNF-α mRNA水平和蛋白水平均有显著增加，在伤后1～8 h内TNF-α的蛋白水平达到最高峰，伤后24 h仍显著高于对照组；此外，SCI后TNF-α通过血脑屏障的转运也明显增加[1,7]。作为SCI后早期出现上调的细胞因子，TNF-α可以激活一系列的蛋白，如蛋白激酶C、磷脂酶A2等，加重继发性SCI的程度[1,8]。因此，通过抑制TNF-α的表达，可以减轻损伤后脊髓组织中过度的炎症级联反应，发挥抗炎作用，可保护脊髓组织和促进受损脊髓功能恢复[8]。

MP被用于治疗SCI已经有40多年历史，目前大剂量MP是美国急性SCI的标准治疗方法,已经成为规范治疗的一部分[9]。MP的抗炎机制是先激活胞质中糖皮质激素受体，形成复合物进入胞核，阻止基因调控蛋白核因子κB(NF-κB)与TNF-α基因启动子部位κB点结合，抑制TNF-α的基因转录和TNF-α mRNA的翻译，阻止TNF-α合成表达，从而减轻SCI后的炎性反应[8]。但也有学者认为MP并不能明显改善SCI患者的预后[10]。

近几年发现，免疫炎性反应还可以通过另外一条通路即CAP来进行调节，该通路通过迷走神经能够显著、快速地抑制巨噬细胞TNF-α的释放,参与和调节外周炎性反应[3,11]。Wang等[11]发现，CAP是通过迷走神经的主要递质乙酰胆碱(Ach)与巨噬细胞上的特异性受体a7nAChR相结合，从而抑制TNF-α的释放。有国外学者相继发现，不仅巨噬细胞上存在有α7nAChR，在神经系统中,神经元及不同的神经胶质细胞中同样有α7nAChR的表达[12],提示这些神经系统细胞也有可能成为胆碱能抗炎作用的靶标[13]。Dougelas等[14]通过研究证明在CNS中确实存在有通过激活a7nAchR而诱导的CAP，这为控制SCI后的继发性炎性反应提供了一个新的思路和方向。

目前已经证明了通过电刺激迷走神经可以促进释放大量乙酰胆碱,进而激活CAP，抑制TNF-α等促炎性因子的上调，减轻全身炎性反应。因此，本研究建立兔SCI模型，采用刺激迷走神经的方法来调节SCI后的继发性炎性反应。结果显示，迷走神经剌激能够降低SCI后脊髓组织内的促炎因子TNF-α的水平，与经典药物MP的作用基本相当。其调节机制可能与外周炎性反应的调节机制相类似，CNS的小胶质细胞和星形胶质细胞等参与炎性反应的细胞通过自分泌、旁分泌或内分泌的方式接受循环血液及组织液中神经递质Ach的调控，激活其表面的α7nAChR，抑制促炎因子TNF-α的产生，从而实现其免疫抑制功能。实验中还发现，刺激迷走神经只能减少SCI部位的TNF-α的蛋白水平，对TNF-α mRNA没有抑制作用，这与Borovikova等[3]的研究结果相一致，表明ACh的抗炎靶点是作用于蛋白，而非转录水平。实验结果显示，在刺激迷走神经的同时结合使用MP，可以进一步降低损伤部位的TNF-α的表达水平，表明两种方法具有协同作用，可能的机制是由于二者的抗炎靶点不同，不存在竞争性抑制。MP的作用靶点是抑制TNF-α的基因转录和翻译[8]，当TNF-α mRNA转录已经开始进行，MP则不能抑制TNF-α的表达，而激活CAP可以对TNF-α的转录后水平发挥抑制作用[3]，从而实现持续性免疫调节过程。

综上所述，SCI后脊髓组织中的TNF-α表达水平快速、显著升高，加剧了继发性SCI。而刺激迷走神经能够通过CAP抑制损伤后脊髓组织中的TNF-α的合成及分泌，发挥有效的抗炎和脊髓保护作用，同时可以辅助或部分替代MP,以避免或减少MP的毒副作用，对继发性SCI的治疗具有非常重要的意义。

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doi:论著·基础研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.007

*基金项目：安徽省教育厅高等学校省级自然科学研究项目(KJ2013Z149)。

作者简介：潘宏(1972-)，副主任医师，博士，主要从事脊柱、创伤研究。

[中图分类号]R651.2

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)15-2051-04

(收稿日期：2015-11-08修回日期：2016-02-16)

Contrastive study of vagus nerve stimulation and methylprednisolone on TNF-α expression in spinal cord tissue after acute spinal cord injury in rabbits*

Pan Hong，Wang Lingzhi,Tao Yuefeng，Jiang Bing，Cao Yanqing，Zheng Yi，Zhang Xiaojun

(DepartmentofOrthopaedics，AffiliatedAnqingMunicipalHospitalofAnhuiMedicalUniversity，Anqing，Anhui246003，China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of vagus nerve stimulation on tumor necrosis factor-α expression in spinal cord tissue after acute spinal cord injury(SCI) in rabbits.And a contrastive study was performed between vagus nerve stimulation and methylprednisolone(MP).MethodsA total of 125 New Zealand white rabbits were divided into sham-operated group(SHAM group,n=5),SCI group(n=25),vagus nerve stimulation group(STM group,n=25),MP group(n=25) and STM+MP group(n=25).The SCI models of rabbits were established by the modified Allen′s weight hit.The right cervical vagus nerves of the rabbits in STM group and STM+MP group were stimulated(5 V,1 Hz,2 ms,lasting 20 min).At the 1,4,8,12,24 hour after SCI,TNF-α protein expressions of spinal cord tissue were detected through enzyme linked immuno sorbent assay (ELISA) and the mRNA levels of TNF-α were measured by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).ResultsThe expressions of TNF-α protein in the spinal cord of STM group,MP group and STM+MP group were less than that of SCI group,and the greatest decrease was observed in STM+MP group.Compared with SCI group and STM group,the expressions of TNF-α mRNA decreased significantly in both MP group and STM+MP group at every time point.ConclusionSTM could reduce the expressions of TNF-α in the spinal cord of rabbits after acute SCI.The effect of vagus nerve stimulation restrained the TNF-α expressions is comparable to MP and have synergistic action with MP in terms of the inhibition of TNF-α expressions.

[Key words]spinal cord injury;tumor necrosis factor-α;methylprednisolone;vagus nerve stimulation