HOXB9和E2F1在结肠癌中的表达及其意义

陈丽梅，康颖娜，程红平，李贵春，方　科△

(1.江西省鹰潭市人民医院肿瘤科　335000；2.湖南省娄底市中心医院肿瘤科　417000)



HOXB9和E2F1在结肠癌中的表达及其意义

陈丽梅1，康颖娜2，程红平1，李贵春1，方科1△

(1.江西省鹰潭市人民医院肿瘤科335000；2.湖南省娄底市中心医院肿瘤科417000)

[摘要]目的探讨同源盒基因9(HOXB9)和E2F1在结肠癌中的表达及其是否存在相关性。方法采用免疫组织化学染色法和Western blot法检测江西省鹰潭市人民医院2012年1月至2015年1月65例结肠癌术后病理标本中结肠癌组织和正常结肠组织中HOXB9和E2F1蛋白的表达，并进行统计学分析。结果HOXB9和E2F1在结肠癌组织中均高表达(P<0.05)，HOXB9在结肠癌中的表达程度与淋巴结转移、远处转移和TNM分期呈正相关(均P<0.05)；而E2F1在结肠癌中的表达程度与浸润深度、淋巴结转移、远处转移和TNM分期呈正相关(均P<0.05)；HOXB9和E2F1在结肠癌组织中的表达呈正相关(P<0.05)。结论HOXB9和E2F1与结肠癌的发生相关，并且在其侵袭转移过程中发挥重要作用。

[关键词]结直肠肿瘤；基因，同源盒；HOXB9；E2F1；侵袭与转移

结肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，近些年其发病率呈上升趋势。尽管随着新型腹腔镜手术方式的开展和新型靶向药物的应用，结肠癌患者5年生存率已经有了很大改善，但病死率仍高。主要死亡原因为肿瘤的复发和远处转移。结肠癌转移相关的基因有血管内皮生长因子(VEGF)、WNT5α和KITENIN，但目前能应用于临床治疗的靶向药物主要靶点只有Ras基因和VEGF[1]。

HOXB9是HOX家族中的成员，包括39个基因，分为4个基因簇，分别是HOX A、B、C和D，并且分布在4条不同染色体上。HOX基因家族在胚胎发育过程中起着重要作用，近些年的研究表明HOX基因家族在肿瘤中有表达，包括白血病、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌和卵巢癌[2]。研究表明，HOXB9是WNT/T细胞因子4(TCF4)信号通路的靶基因，WNT/TCF4信号通路参与了细胞增殖、分化、胚胎分割和四肢形成等过程[3]。HOXB9还可通过上皮细胞间充质转化(EMT)途径促进新生血管形成和远处转移从而促进乳腺癌进展[4]。研究表明，HOXB9蛋白在乳腺癌中表达上调并促进肿瘤进展，并且在乳腺癌中的研究显示E2F1可以与HOXB9基因的转录因子结合位点结合，上调HOXB9的表达[5]。在实体标本中免疫组织化学结果也证实HOXB9和E2F1表达存在显著的相关性(P<0.01)。但在胃癌中表达却下降，低表达的HOXB9与胃癌的不良预后有关[6]。

但在结肠癌中的观点有分歧，Zhan等[2]认为HOXB9在分化良好的结肠癌患者组织中高表达，并且与较长的生存时间相关，并且体外实验显示HOXB9过表达可以抑制结肠癌细胞生长、侵袭、转移。但Huang等[1]却认为HOXB9在结肠癌组织中过表达，并且与转移和不良预后相关(P<0.05)。在转移淋巴结中发现HOXB9高表达，下调HOXB9表达后可以抑制癌细胞的迁移和侵袭能力，而增强HOXB9的表达却能加强癌细胞的侵袭和迁移。笔者为了证实HOXB9在结肠癌中是否高表达，是否与肿瘤的侵袭转移有关，开展了本研究，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料选取江西省鹰潭市人民医院2012年1月至2015年1月经病理确诊的结肠癌术后新鲜标本和石蜡包埋的病理标本65例，分别选择结肠癌阴性切缘(正常结肠组织，距肿瘤组织5～8 cm)和结肠癌组织进行切片。

1.2主要试剂免疫组织化学一抗为美国Molecular Tag公司原装进口；多聚赖氨酸、SP二抗试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自镇江厚普生物科技有限公司进口分装；Western blot一抗为兔抗人HOXB9多克隆抗体、兔抗人E2F1多克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体均购自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.3方法

1.3.1免疫组织化学法采用免疫组织化学染色SP法检测人结肠癌术后标本中肿瘤组织和阴性切缘中HOXB9和E2F1的表达部位及强度。操作步骤：切片4 μm，60 ℃烤片过夜；常规脱蜡水化，水洗；高温、高压修复5 min；滴加一抗4 ℃过夜；滴加二抗；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液37 ℃，20 min；DAB显色；苏木素复染；显微镜观察；图像分析。

1.3.2Western blot法取术后新鲜病理标本，在肿瘤组织和阴性结肠切缘进行取材，将组织剪碎，使用细胞裂解液提取蛋白。用蛋白质定量试剂盒(BCA)法进行蛋白水平测定。取75～100 μg蛋白在100 g/L进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，后转移至硝基纤维素滤膜，50 g/L脱脂奶37 ℃封闭1 h，加入兔抗人一抗，于4 ℃孵育过夜；加入羊抗兔二抗常温孵育1 h，在凝胶1次成像仪内曝光成像，以β-actin为内参照。

1.3.3结果判定HOXB9和E2F1染色阳性信号为细胞核出现棕黄色颗粒，每张切片选取5个高倍镜视野(细胞计数200)，观察阳性细胞染色强度并计数阳性细胞百分率。首先按照染色强度计分：0分为无染色，1分为浅黄色，2分为黄色，3分为棕黄色；再按照阳性细胞百分比计分：阳性细胞小于5%为0分；5%～<25%为1分，25%～<50%为2分，50%～<75%为3分，大于或等于75%为4分。二者相乘为最后得分[7]。并采用最后得分作为染色程度进行统计学分析。

1.4统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行分析。免疫组织化学结果为等级资料，采用配对Wilcoxon秩和检验；病理学参数和免疫组织化学数据为等级资料，他们之间的相关性分析采用两变量之间的Spearman秩相关分析。检验水准α=0.05。以P<0.05为差异有统计学。

2结果

2.1HOXB9和E2F1在结肠癌中高表达HOXB9和E2F1在正常结肠组织和结肠癌中的免疫组织化学染色图片，见图1～4。从图1、2的比较可以看出HOXB9在结肠癌细胞的细胞核中深染，呈棕黄色。在正常结肠组织细胞核中淡染。同一个视野下染色细胞数量较正常结肠组织中多，可以认为HOXB9在结肠癌中高表达；同样，从图3、4的比较可以看出E2F1在结肠癌细胞胞核中深染，在正常结肠组织中淡染，并且同一个视野下染色细胞较正常结肠组织明显多。Western blot 结果也显示肿瘤组织中HOXB9和E2F1高表达，正常结肠组织中少量表达，与免疫组织化学结果相符(图5)。以免疫组织化学最后评分代表HOXB9和E2F1的免疫组织化学染色程度，其值的高低表示HOXB9和E2F1的表达程度高低。对正常结肠组织和结肠癌组织中HOXB9和E2F1免疫组织化学染色评分进行配对样本Wilcoxon秩和检验，HOXB9在结肠癌和正常结肠组织中的表达差异有统计学意义(Z=-6.943,P<0.05)，在结肠癌组织中高表达。E2F1在结肠癌组织中也处于高表达，差异有统计学意义(Z=-7.023，P<0.05)，见表1。

图1　HOXB9在结肠癌组织中的表达(SP,×100)

图2　HOXB9在正常结肠组织中的表达(SP,×100)

图3　E2F1在结肠癌组织中的表达(SP,×400)

图4　E2F1在正常结肠组织中的表达(SP，×100)

图5　HoxB9和E2F1的Western blot 成像结果

项目n免疫组织化学染色评分1分2分3分4分6分8分9分ZP正常结肠组织HOXB96594367000-6.9430.000结肠癌组织HOXB9650101537012正常结肠组织E2F165124265000-7.0230.000结肠癌组织E2F16500095015

2.2HOXB9的表达程度与结肠癌病理学参数的关系将HOXB9在结肠癌的免疫组织化学染色评分结果与患者的性别、年龄、肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移和病理分期(AJCC2003年版TNM分期)分别进行Spearman秩相关分析，HOXB9在结肠癌中的表达与性别、年龄、分化程度、浸润深度无相关(P>0.05)，而HOXB9在结肠癌中的表达程度与淋巴结转移、远处转移、TNM分期均呈正相关(r=0.406、0.550、0.475，P<0.05)，见表2。

表2　HOXB9表达与结肠癌病理学参数的Spearman秩相关分析

2.3E2F1的表达程度与结肠癌病理学参数的关系同样，将E2F1在结肠癌的免疫组织化学染色评分结果与患者的性别、年龄、肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移和病理分期分别进行Spearman秩相关分析，E2F1在结肠癌中的表达与性别、年龄、分化程度均无相关，差异无统计学意义(P>0.05)。而E2F1在结肠癌中的表达程度与浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期呈正相关(r=0.295、0.387、0.542、0.375，P<0.05)，见表3。

表3　E2F1表达与结肠癌病理学参数的Spearman秩相关分析

2.4HOXB9与E2F1在结肠癌中的表达关系将HOXB9与E2F1在结肠癌中的表达程度作Spearman检验，HOXB9、E2F1在结肠癌和正常结肠组织中的表达均无相关性(P>0.05)；而HOXB9和E2F1在结肠癌组织中的表达呈正相关(r=0.356，P<0.05)，见表4。

表4　HOXB9与E2F1在结肠癌中表达的Spearman秩相关分析

3讨论

结肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，也是美国癌症相关病死率中位于第2位，每年全球也有将近120万新发结肠癌患者[8]。Ⅰ、Ⅱ、ⅢA期结肠癌手术治疗效果好，转移性结肠癌治疗以化疗为主，近几十年以表皮生长因子受体(EGFR)、VEGF等靶点的分子靶向治疗取得了很大进步。但这些靶向药物通常需联合化疗，单独应用效果不佳，通常只能作为二、三线方案，或不适合化疗的患者。因此更多的治疗靶点有待挖掘。

HOXB9在多种肿瘤组织中高表达，并且与肿瘤的侵袭转移和不良预后相关。研究显示E2F1可以结合到HOXB9基因启动子-404至-392核苷酸区域，促进基因转录，HOXB9可以活化TGFβ-ATM轴，引起细胞周期检查点活化和启动基因修复，从而使细胞从G1期到S期，启动细胞增殖[5]。本研究结果显示，HOXB9和E2F1在结肠癌组织中均高表达，在正常结肠组织中低表达，差异有统计学意义(P<0.05)。而且HOXB9和E2F1在结肠癌组织中的表达程度与在相应正常结肠组织中的表达程度无相关性(P>0.05)，也就是说在结肠癌组织中高表达并不受正常结肠组织中表达程度的影响。可以认为HOXB9和E2F1在结肠癌形成过程中发挥作用。

HOXB9在结肠癌中的表达程度与淋巴结转移程度、远处转移、TNM分期均呈正相关(P<0.05)。结肠癌患者淋巴结转移程度越高，HOXB9蛋白表达越高，有远处转移患者HOXB9表达越高，TNM分期越晚，其表达程度越高。而E2F1在结肠癌中的表达程度与浸润深度、淋巴结转移程度、远处转移、TNM分期均呈正相关(P<0.05)。同样，结肠癌浸润越深、淋巴结转移程度越高，E2F1表达程度越高，有远处转移患者E2F1表达程度也越高，以及TNM分期越晚，其表达程度也越高。淋巴结转移、远处转移和TNM分期正是结肠癌侵袭转移的病理学参数，结合本研究结果，可以看出HOXB9和E2F1可能在结肠癌浸润转移中发挥着重要的作用。并且在结肠癌组织中，HOXB9和E2F1的表达也呈正相关(P<0.05)，这与他们之间的相互作用关系有关。正是由于E2F1可以结合到HOXB9启动子区域，促进其转录，如果能阻断这一相互作用，就能有效抑制结肠癌的转移过程。

总之，HOXB9和E2F1在结肠癌组织中高表达，可能参与了结肠癌的形成过程，并且与结肠癌的侵袭转移有关。但是否能针对HOXB9与E2F1研究有效的治疗药物还需要进行阻断这一相互作用的药物进行结肠癌动物模型的实验。

参考文献

[1]Huang K,Yuan R,Wang K,et al.Overexpression of HOXB9 promotes metastasis and indicates poor prognosis in colon cancer[J].Chin J Cancer Res,2014,26(1):72-80.

[2]Zhan J,Wang P,Niu M,et al.High expression of transcriptional factor HOXB9 predicts poor prognosis in patients with lung adenocarcinoma[J].Histopathology,2015,66(7):955-965.

[3]Hatzis P,van del Flier LG,van Driel MA,et al.Genome-wide pattern of tcf712/tcf4 chromatin occupancy in colorectal cancer cells[J].Mol Cell Biol,2008,28(8):2732-2744.

[4]Chiba N,Comaills V,Shiotani B,et al.Homeobox b9 induces epithelial-to-mesenchymal transition-associated radioresistance by accelerating DNA damage responses[J].ProcNati Acad Sci U S A,2012,109(8):2760-2765.

[5]Zhussupova A,Hayashida T,Takahashi M,et al.An E2F1-HOXB9 transcriptional circuit is associated with breast cancer progression[J].PLoS One,2014,9(8):e105285.

[6]Sha S,Gu Y,Xu B,et al.Decreased expression of hoxb9 is related to poor overall survival in patients with gastric carcinoma[J].Dig liver Dis,2013,45(5):422-429.

[7]方科,庄建良,苏子剑,等.成纤维细胞生长因子19和成纤维细胞生长因子受体4在食管鳞癌中的表达及其意义[J].重庆医科大学学报,2013，38(8):876-880.

[8]Recondo G,Diaz-Canton E,de la Vega M,et al.Advances and new perspectives in the treatment of metastatic colon cancer[J].World J Gastrointest Oncol,2014,6(7):211-224.

作者简介：陈丽梅(1984-)，主治医师，本科，主要从事消化系统肿瘤研究。 △通讯作者，E-mail:fangkeqq88@163.com。

doi:·经验交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.023

[中图分类号]R735.1

[文献标识码]B

[文章编号]1671-8348(2016)15-2104-03

(收稿日期：2015-11-28修回日期：2016-02-06)