过敏性紫癜患儿SOCS3、HMGB1的表达及意义

王凤英，黄路圣，鲁　曼，张泰山

(1.江苏省泰兴市人民医院儿科　225400；2.山东省泰安市中心医院儿科　271000)



过敏性紫癜患儿SOCS3、HMGB1的表达及意义

王凤英1，黄路圣1，鲁曼2，张泰山2

(1.江苏省泰兴市人民医院儿科225400；2.山东省泰安市中心医院儿科271000)

[摘要]目的研究过敏性紫癜患儿外周血SOCS3和HMGB1的表达及其相互关系和临床意义。方法选取过敏性紫癜儿童(HSP组)20例和正常健康儿童(对照组)15例。应用逆转录-聚合酶链反应检测外周血单个核细胞中SOCS3 mRNA表达水平，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清HMGB1的水平。结果HSP组外周血单个核细胞SOCS3 mRNA表达量和血清HMGB1的表达量分别为1.87±0.53、(16.29±3.28)μg/L，高于对照组的0.77±0.13、(7.44±1.34)μg/L，差异均有统计学意义(P<0.01)，且二者成正相关(r=0.816，P<0.01)。混合型HSP患儿SOCS3 mRNA表达量和血清HMGB1的表达量较单纯型患儿的表达量增高，差异均有统计学意义(P<0.05)。HSP患儿SOCS3 mRNA表达量和血清HMGB1的表达量无性别差异。结论SOCS3和HMGB1可能参与了儿童HSP的发病。

[关键词]HMGB1蛋白质；紫癜，过敏性；细胞因子信号转导抑制蛋白3；儿童

过敏性紫癜(HSP)是一种以小血管为主要病变的变态反应性疾病，迄今为止其发病机制尚未完全清楚[1]。研究表明，在HSP患儿急性期体内存在辅助性T细胞(Th)1/Th2的失衡，主要表现为Th2的优势活化[2]。细胞因子信号转导抑制蛋白3(SOCS3)主要表达在Th2细胞，促进Th2细胞的分化，抑制Th1细胞分化，使Th2型反应增强[3-4]。高迁移率族蛋白1(HMGB1)是一种新型的炎性细胞因子，研究发现HMGB1参与了多种自身免疫性疾病的发生和发展[5]。目前SOCS3和HMGB1在HSP患儿中的研究报道较少。本课题研究了SOCS3和HMGB1在HSP患儿外周血中的表达及相关性，以探讨其在HSP发病中的作用及意义，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料选取HSP患儿与健康体检儿童进行对比研究，经医院伦理委员会批准，均取得受试对象家长知情同意。HSP患儿20例(HSP组)，诊断均符合诸福棠儿科学第7版HSP诊断标准及2013年中华医学会儿科学分会免疫学组制订的儿童过敏性紫癜循证诊治建议，在受检前4周内未使用任何糖皮质激素或细胞毒性药物。其中，男11例，女9例；平均年龄(7.4±2.2)岁；单纯皮肤型5例，混合型15例(有12例伴关节症状，9例伴消化道症状，5例伴肾脏损害)。对照组为健康体检儿童随机抽样15例，男8例、女7例；平均年龄(7.2±1.6)岁。HSP组与对照组年龄及性别差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1实验标本的采集部位：外周静脉血。试管：采用肝素钠抗凝管和非肝素钠抗凝管。采集对象：HSP组治疗前及对照组。采血量：每管各2 mL。

1.2.2实验标本的处理采用密度梯度离心法将肝素钠抗凝管分离出外周血单个核细胞(PBMC)，以备检测SOCS3 mRNA表达，非肝素钠抗凝管离心取血清，-20 ℃冰箱保存以备待测 HMGB1水平。

1.2.3SOCS3 mRNA表达水平检测(1)mRNA提取和cDNA合成。试剂来源：采用山东赛恩斯科技有限公司代购的Invitrogen公司的mRNA提取试剂、美国Thermo公司的反转录试剂盒和SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR试剂盒。实验步骤：严格按照Trizol试剂盒说明书的步骤用PBMC提取mRNA，然后将mRNA逆转录为cDNA，在0.2 mL的EP管里进行，逆转录反应总体系为20 μL。(2)SOCS3基因的表达量应用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR试剂检测，反应体系为50 μL(SYBR Green Ⅰ 25 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，加双蒸水至50 μL)；PCR反应条件：95 ℃ 1 min变性；再95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40个循环。所用PCR仪为ABI Prism 7500，以β-actin作为内参基因，SOCS3、β-actin的引物设计和合成由宝生物工程有限公司完成，目的基因和内参基因的引物序列见表1。(3)SOCS3 mRNA表达水平用SOCS3△Ct值表示，△Ct为目的基因Ct值与β-actin Ct值的差异，为基因的相对表达量。

表1　目的基因和内参基因的引物序列

1.2.4HMGB1的检测试剂购自上海百沃科技有限公司。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测其HMGB1血清水平，严格按照试剂盒说明书要求进行。浓度的计算：以标准品浓度作为横坐标，吸光度(OD)值作为纵坐标，绘制标准曲线，得出标准方程，根据标准方程计算。

2结果

2.1两组SOCS3 mRNA及HMGB1的比较HSP组SOCS3 mRNA表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。HSP组血清HMGB1水平较对照组增高，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。HSP组SOCS3 mRNA 和HMGB1的表达量成正相关(r=0.816，P<0.01)。

2.2临床类型不同的HSP患儿SOCS3 mRNA、HMGB1检测结果比较混合型HSP患儿SOCS3 mRNA和HMGB1的表达量分别为2.05±0.480、(17.45±2.90)μg/L；单纯型患儿SOCS3 mRNA和HMGB1的表达量分别为1.34±0.16、(12.82±1.23)μg/L；混合型HSP患儿SOCS3 mRNA和HMGB1的表达量较单纯型患儿的表达量明显增高，差异有统计学意义(t=3.18、3.41，P=0.005、0.003)。

表2　HSP组与对照组SOCS3 mRNA、HMGB1表达差异

2.3性别不同HSP患儿SOCS3 mRNA、HMGB1检测结果比较男性HSP患儿SOCS3 mRNA和HMGB1的表达量分别为1.80±0.56、(16.34±2.99)μg/L；女性患儿SOCS3 mRNA和HMGB1的表达量分别为1.95±0.49、(16.23±3.78)μg/L；不同性别HSP患儿SOCS3 mRNA和HMGB1的表达量差异无统计学意义(t=0.62、0.07，P=0.539、0.945)。

3讨论

SOCS3和SOCS1是SOCS家族中研究较深入的成员之一，可通过多种途径负向调控JAK-STAT(Janus kinase/signal transducers and activators of transcription)信号通路，影响多种炎症细胞因子的表达与释放，参与免疫性、炎症性疾病的发生和发展[6-7]。SOCS1在Thl细胞中高表达，SOCS3在Th2细胞中高表达；白细胞介素(IL)-12/STAT4、 IL-4/STAT6途径分别是Th1、Th2分化所必需的[8]。研究表明SOCS1可使Th1型反应增强，而SOCS3可使Th2型反应增强，作用机制分别为抑制IL-4/STAT6和IL-12/STAT4通路信号的传导[3-4]。研究已证实HSP是Th2细胞及其细胞因子占优势的变态反应性疾病[2]。本研究结果显示，HSP患儿SOCS3的表达量较健康儿童明显增高，且混合型HSP较单纯型HSP患儿的表达量增高更明显，推测HSP患儿在体内炎性因子的作用下，表达显著增高的SOCS3促使HSP患儿表现为Th2的优势活化，SOCS3表达越高的患儿越易合并皮肤外的脏器受累，提示SOCS3表达越高者炎性反应越重，故SOCS3可能参与了儿童HSP的发病。本研究HSP患儿SOCS3表达量未发现有性别差异。

HMGB1是一种非组蛋白的核 DNA 结合蛋白，是HMG超家族成员之一，生理状态下结合于核染色体，参与DNA的复制、转录、翻译和修复等生命活动，病理状态下是一种促炎介质，具有细胞因子的功能，同时也可作为损伤相关分子模式家族(damage-associated molecular patterns，DAMPs)成员激活抗原提呈细胞(APC)，启动增强适应性免疫应答，参与免疫细胞的分化、成熟和活化，进一步参与多种疾病的病理变化[9-10]。既往研究表明HMGB1具有广泛的免疫活性，促进一系列免疫炎性细胞因子如单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、IL-1、IL-6、IL-8、基质金属蛋白酶(MMP)等及趋化因子和黏附因子的大量释放[10]；反之，肿瘤坏死因子(TNF-α)、脂多糖(LPS)、IL-1等多种炎症介质能促使单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞等加速表达和分泌HMGB1，不断放大炎性信号，导致炎性反应失控[11]。在HSP发病中有多种细胞因子的参与，如TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-26、IL-28、血管内皮生长因子(VEGF)等均可能是参与HSP发病的重要因子。Chen等[12]研究发现HMGB1可能通过诱导TNF-α和IL-6介导HSP的血管内皮炎症，进一步参与HSP的病理发展。本研究结果显示HSP组HMGB1血清水平较对照组显著增高，表达差异有统计学意义，且混合型HSP患儿HMGB1血清水平较单纯型HSP增高，差异有统计学意义，提示HMGB1可能参与了儿童HSP的发病。HMGB1的水平越高，病情越重，累积的脏器越多，但表达量无性别差异，与甘世伟等[13]的报道相一致。

Huang等[14]研究表明大剂量HMGB1能诱导人或鼠T淋巴细胞向Th2功能性分化，降低Th1/Th2比例，出现Th2优势。郭惠芳等[15]研究表明HMGB1刺激能增加细胞SOCS1、SOCS3的表达。本研究表明HSP患儿SOCS3的表达和HMGB1的表达量均增高，且二者表达成正相关，由此推测HSP患儿体内增高的SOCS3和HMGB1相互作用，促使HSP患儿出现TH2细胞优势活化及相应细胞因子的分泌，加之HMGB1本身及活化的免疫炎症细胞，破坏免疫平衡，导致全身小血管的损伤和炎症。

研究认为SOCS、HMGB1可作为靶点干预治疗多种免疫相关疾病，本课题组拟进一步探索SOCS3、HMGB1参与HSP发病的分子机制及相互作用机制，为SOSC3、HMGB1治疗HSP等免疫性疾病的临床应用提供理论基础。

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作者简介：王凤英(1975-)，副主任医师，硕士，主要从事小儿免疫性疾病研究。

doi:·经验交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.033

[中图分类号]R725.9

[文献标识码]B

[文章编号]1671-8348(2016)15-2130-03

(收稿日期：2015-11-15修回日期：2016-01-16)