卤米松与他扎罗汀对角质形成细胞RAR-γ和RXR-α表达的影响*

王玉娟,张　斌,何　威,王儒鹏,周春丽，刘　莲，王　为，黄　珂

(第三军医大学新桥医院皮肤科，重庆 400037)



卤米松与他扎罗汀对角质形成细胞RAR-γ和RXR-α表达的影响*

王玉娟,张斌,何威△,王儒鹏,周春丽，刘莲，王为，黄珂

(第三军医大学新桥医院皮肤科，重庆 400037)

[摘要]目的观察不同浓度卤米松和他扎罗汀对体外培养人永生化HaCaT角质形成细胞的维甲酸受体(RAR)-γ和维甲酸X受体(RXR)-α表达的影响，探讨卤米松对他扎罗汀治疗银屑病效应的潜在影响。方法CCK-8方法检测不同浓度卤米松和他扎罗汀对HaCaT细胞增殖的影响；Western blot法和实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测不同浓度卤米松和他扎罗汀作用12 h、24 h 后，HaCaT细胞中RAR-γ和RXR-α 的mRNA水平和蛋白水平的变化。结果卤米松和他扎罗汀均可抑制角质形成细胞增殖。卤米松使HaCaT细胞的RAR-γ和RXR-α mRNA水平和蛋白水平升高。他扎罗汀作用后RAR-γ和RXR-α的mRNA水平降低，而蛋白水平在12 h升高，24 h降低。结论卤米松作用角质形成细胞后可上调RAR-γ和RXR-α表达，这可能有助于提高角质形成细胞对他扎罗汀作用的反应性，从而提高他扎罗汀的作用效应。

[关键词]RNA，信使；银屑病；受体，维甲酸；卤米松；他扎罗汀；HaCaT细胞；RAR-γ；RXR-α

银屑病是皮肤科临床上常见的慢性、复发性、炎症性皮肤病，外用疗法是目前银屑病治疗的主要方法之一，糖皮质激素与他扎罗汀联合使用治疗银屑病已得到多国银屑病治疗指南的肯定[1-3]。作为核激素受体超家族成员，糖皮质激素与维甲酸均通过与其各自的受体结合而发挥药理效应。鉴于核受体超家族成员间可能存在着一定程度的相互影响[4-5]，当外用激素与他扎罗汀联合治疗银屑病时，糖皮质激素是否会对他扎罗汀的治疗效应产生影响尚有待探索。为此，本研究以HaCaT角质形成细胞为研究对象，以表皮中表达量最高的维甲酸受体(RAR)-γ和维甲酸X受体(RXR)-α[6-7]为主要研究指标，观察不同浓度卤米松和他扎罗汀作用对角质形成细胞中RAR-γ和RXR-α的表达影响，以探讨卤米松对他扎罗汀治疗银屑病效应的潜在影响。

1材料与方法

1.1材料HaCaT细胞购于中科院上海细胞所。主要试剂及器材：RPMI 1640 培养液(Hyclone)，胎牛血清(杭州四季青生物公司)，兔抗人RAR-γ多克隆抗体、兔抗人RXR-α多克隆抗体(美国Santa Cruz)，辣根过氧酶标记的羊抗兔二抗(北京中杉金桥)，电化学发光(ECL)显色试剂盒(碧云天)，聚偏二氧乙烯膜(PVDF膜，Millipore)，卤米松(香港澳美制药有限公司)，他扎罗汀(美国Sigma公司)，实时荧光定量PCR(RT-PCR)仪(ViiA7DX,新加坡ABI)，超灵敏凝胶成像系统(LAS4010，美国GE)，CCK-8试剂盒(日本同仁化学)。

1.2方法

1.2.1细胞培养将HaCaT细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养液，在37 ℃，5% CO2孵箱中培养，1～2 d传代1次，待细胞传至3～5代时接种至孔板。

1.2.2卤米松和他扎罗汀的使用及分组将卤米松和他扎罗汀溶于DMSO配成10-2mol/L原液，临用时用培养基配成终浓度。根据预实验和国外相关研究设定他扎罗汀的浓度为10-9、10-8、10-7、10-6mol/L为他扎罗汀处理组[8]，依次命名为T9组、T8组、T7组、T6组；根据预实验和国外相关研究设定卤米松的浓度为10-9、10-8、10-7、10-6mol/L为卤米松处理组，依次命名为H9组、H8组、H7组、H6组，同时设定DMSO为空白对照组。分别作用HaCaT细胞12、24 h后，收集细胞提取总RNA和总蛋白。

1.2.3细胞增殖测定将传至3～5代的细胞接种至96孔板，每孔细胞接种数约(4～5)×104，按照上述设置的浓度和分组进行培养。12 h后弃去原培养基，每孔加入100 μL用无血清培养基稀释CCK-8试剂，30 min后在酶标仪上设定波长450 μm检测光密度(OD值)。

1.2.4细胞总RNA提取参照RNAiso Plus说明书进行RNA提取，应用分光光度计测定RNA的浓度和纯度(A260/A280)，并取适量RNA进行琼脂糖凝胶电泳证实RNA的质量。

1.2.5引物设计与合成RXR-α引物上游：5′-TGC GCA AGG ACC TGA CCT ACA C-3′，下游：5′-GAC TCC ACC TCA TTC TCG TTC CG-3′；RAR-γ引物上游：5′-AGA GAG GGC AAA GGG ATG AG-3′，下游5′-GTG GAA TGG CAG GTC TTC-3′；用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作内参校准基因，上游：5′-CAT CAA GAA GGT GGT GAA GCA G-3′，下游：5′-CGT CAA AGG TGG AGG AGT GG-3′。以上引物由上海生工生物公司设计和Invitrogen公司合成。

1.2.6反转录cDNA RT-PCR反应和结果分析按照PrimeScriptTMRT reagent Kit(日本 TaKaRa公司)试剂盒说明书进行反转录，将得到的cDNA模板于ViiA7DX PCR仪上进行RT-PCR反应。20.0 μL体系中含上下游引物各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，扩增步骤和条件：(1)预变性，1个循环 95 ℃ 30 s；(2)PCR反应，40个循环 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s；(3)溶解曲线，90 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCT法，ΔΔCT=实验组(CT目的-CT内参)-对照组(CT目的-CT内参)，对结果进行分析。

1.2.7Western blot分别收集各药物浓度处理组及空白对照组总蛋白用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，加入1 mL PBS于细胞培养瓶中，用细胞刮刮下细胞后吸入至离心管，4 ℃ 3 000 r/min离心3 min，去上清液，加入预冷的细胞蛋白裂解液冰上裂解20 min，4 ℃ 12 000 r/min 离心5 min，吸取上清液于新的离心管中用BCA法测蛋白浓度。按照蛋白总体积∶十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上样缓冲液为4∶1的比例加入上样缓冲液，煮沸使蛋白变性。配SDS-PAGE：下层10%分离胶和上层5%浓缩胶。100 V恒压电泳，电泳结束后将蛋白转印到PVDF膜上(270 mA，90 min)，5%的脱脂奶粉室温下封闭2 h，TBST洗膜3次×5 min，加入第一抗体：RAR-γ 1/200； RXR-α 1/200；GAPDH为内参抗体，工作浓度为1/1 000，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次×15 min，目的蛋白膜上加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗1/5 000，GAPDH膜上加入辣根过氧化酶标记的羊抗鼠二抗1/5 000，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3×15 min。最后按ECL显色试剂盒说明书显色。

2结果

2.1卤米松与他扎罗汀对角质形成细胞增殖活性的影响随着卤米松和他扎罗汀浓度的升高，OD值降低，细胞的增殖活力越弱，见图1。

2.2卤米松对角质形成细胞中RAR-γ和RXR-α表达的影响

2.2.1卤米松对HaCaT细胞RAR-γ和RXR-α mRNA表达的影响RAR-γ在卤米松处理组均比在空白对照组的基因水平表达量高，随着卤米松浓度的增高，RAR-γ mRNA表达水平增高，差异有统计学意义(F=32.983，P=0.000)。RXR-α在卤米松作用于HaCaT细胞12 h后均比空白对照组的相对表达量低，但RXR-α在卤米松作用HaCaT细胞24 h后比空白对照组表达高，且随着浓度的增高而增高，差异有统计学意义(F=71.763，P=0.000)，见图2。

A：卤米松处理组；B：他扎罗汀处理组。

图1不同浓度卤米松和他扎罗汀作用HaCaT细胞12 hOD值

A：RAR-γ mRNA水平；B：RXR-α mRNA水平。

图2不同浓度卤米松作用12 h和24 h对RAR-γ和RXR-α mRNA表达的影响

2.2.2卤米松对HaCaT细胞RAR-γ和RXR-α蛋白水平的影响不同浓度卤米松作用于角质形成细胞后RAR-γ和RXR-α蛋白水平均比空白对照组高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

A：Western blot检测结果；B：RAR-γ蛋白水平；C：RXR-α蛋白水平。

图3不同浓度卤米松作用HaCaT细胞12 h和24 h后RAR-γ和RXR-α蛋白水平

2.3他扎罗汀对RAR-γ和RXR-α表达的影响

2.3.1他扎罗汀对HaCaT细胞RAR-γ和RXR-α的mRNA水平的影响RAR-γ和RXR-α mRNA在他扎罗汀作用HaCaT细胞12 h和24 h后均比空白对照组的相对表达量降低，差异有统计学意义(P<0.05)，但不存在浓度依赖关系，见图4。

A：RAR-γ mRNA水平；B：RXR-α mRNA水平。

图4不同浓度他扎罗汀作用HaCaT细胞12 h和24 h后RAR-γ和RXR-α基因的影响

2.3.2他扎罗汀对HaCaT细胞RAR-γ和RXR-α蛋白水平的影响不同浓度他扎罗汀作用于角质形成细胞12 h后RAR-γ和RXR-α蛋白表达量比空白对照组高，但24 h后蛋白表达量降低，见图5。

A：Western blot检测结果；B：RAR-γ蛋白水平；C：RXR-α蛋白水平。

图5不同浓度他扎罗汀作用HaCaT细胞12 h和24 hRAR-γ和RXR-α蛋白水平

3讨论

银屑病是皮肤科临床上常见的以红斑鳞屑为主要临床表现的慢性、复发性、炎症性皮肤病，病因及发病机制尚未完全明确，病理上以表皮细胞过度增殖、异常分化等为主要特征。外用疗法是治疗银屑病的主要手段，糖皮质激素、维甲酸类药物、维生素D3衍生物等是目前银屑病外用疗法中的常用药物[9]。卤米松是一种具有抗炎、抗过敏、收缩血管、止痒、对局部皮损有免疫调节作用的强效糖皮质激素外用制剂，其起效迅速、作用强大，但长期使用会引起皮肤局部萎缩、色素沉着等不良反应，限制了其临床的应用。他扎罗汀作为第3代维甲酸药物，具有调节表皮分化和增殖等作用，促使角质形成细胞异常分化正常化，降低角质形成细胞的增生和降低炎症标志物的表达，使皮肤恢复正常。二者联合使用既减少了激素的剂量，增强了疗效，还减少了不良反应，但其具体机制尚未见报道。

本研究发现卤米松与他扎罗汀作用角质形成细胞后均可抑制角质形成细胞增殖，二者联用可增强彼此的抑制作用，提示激素和维甲酸类药物对角质形成细胞有抗增殖的能力，从而使角化过度的角质形成细胞趋于正常化，达到治疗目的。目前研究已确定，糖皮质激素主要是通过与细胞质中的核激素受体GRα结合而发挥生物学作用，GC与GRα的复合体移位至细胞核内与糖皮质激素受体操纵元件(GRE)结合后，进而调控基因的转录和表达[10]。维甲酸的调节作用通过RAR和RXR介导发挥，二者的受体均属于核激素受体家族成员。众多研究表明，核受体超家族成员间可能存在交叉对话，且RXR与其他核受体之间形成二聚体发挥作用。鉴于此，Yamaguchi等[11]研究地塞米松作用小鼠肝细胞对RXR的影响，发现地塞米松能增加RXR-α的mRNA水平和蛋白水平，增强甲状腺激素的活性。而Grummer等[12]发现地塞米松作用小鼠肺泡细胞后等增加RAR-β和表面蛋白C的表达，促进肺泡细胞分化和发育。本研究也发现，他扎罗汀作用角质形成细胞后以下调RAR-γ和RXR-α表达为主，而卤米松作用角质形成细胞后上调细胞中RAR-γ和RXR-α表达，因而可能通过此路径达到增加他扎罗汀调节角质形成细胞正常分化、抗增殖的活性的作用，以提高其治疗银屑病的效应，在一定程度上解释了临床上卤米松联合他扎罗汀治疗银屑病疗效优于单用的现象，为临床上外用激素与他扎罗汀联合治疗银屑病提供了一定的实验研究依据和理论基础。但其具体机制尚待进一步研究证实。

参考文献

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[12]Grummer MA,Zachman RD.Retinoic acid and dexamethasone affect RAR-beta and surfactant protein C mRNA in the MLE lung cell line[J].Am J Physiol,1998,274(1 Pt 1):L1-7.

doi:论著·基础研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.006

*基金项目：中华医学会皮肤性病学分会-澳美制药银屑病研究基金资助项目。

作者简介：王玉娟(1989-)，住院医师，在读硕士， 主要从事卤米松调节他扎罗汀对表皮细胞作用的影响及机制研究。 △通讯作者，E-mail:weiheskin@163.com。

[中图分类号]R758.63

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)15-2048-03

(收稿日期：2015-11-15修回日期：2016-02-16)

Effects of halometasone and tazarotene on expression of RAR-γ and RXR-α in human keratinocytes*

Wang Yujuan,Zhang Bin,He Wei△,Wang Rupeng,Zhou Chunli,Liu Lian,Wang Wei,Huang Ke

(DepartmentofDermatology,XinqiaoHospital,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037，China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of halometasone and tazarotene on the expression of retinoic acid receptors (RAR-γ、RXR-α) in cultured immortalized keratinocyte line-HaCaT cell in vitro,and to explore the potential effect of halometasone on tazarotene in psoriasis treatment.MethodsCCK-8 was used to detect the cell proliferation of HaCaT cells treated by different concentration of halometasone and tazarotene.The expressions of RAR-γ and RXR-α mRNA and protein in HaCaT cells treated by different concentration of halometasone and tazarotene for 12 h and 24 h were detected by RT-PCR and western blotting.ResultsHalometasone and tazarotene both inhibited cell proliferation of keratinocytes.The expressions of RAR-γ and RXR-α were increased through treatment with halometasone for 12 h and 24 h.And the mRNA expression of RAR-γ and RXR-α were decreased with tazarotene treatment,while the expressions of protein was increased after 12 h and decreased after 24 h.ConclusionThe expressions of RAR-γ and RXR-α are upregulated by halometasone in keratinocytes,which might contributes to improve the activity of tazarotene and raise its effect.

[Key words]RNA，messenger；psoriasis；receptors,retinoic acid;halometasone;tazarotene;HaCaT cell;RAR-γ;RXR-α