裂殖壶菌菌株FJU-512油脂提取的细胞破壁工艺

何文胜，王　灿，杨诗颖

(1.福建生物工程职业技术学院，福建福州350002；2.福建师范大学 生命科学学院，工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心，福建福州350117)



·研究简报·

裂殖壶菌菌株FJU-512油脂提取的细胞破壁工艺

何文胜1,2*，王灿2，杨诗颖2

(1.福建生物工程职业技术学院，福建福州350002；2.福建师范大学 生命科学学院，工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心，福建福州350117)

摘要：裂殖壶菌(Schizochytrium)是目前用于商业化生产二十二碳六烯酸(DHA)的高产菌种之一，由于DHA属于胞内油脂，因此对其进行充分破壁是工业化提取DHA的关键工序.研究了酸热法、碱热法、超声波法以及酶法对裂殖壶菌细胞破壁的影响，考察了不同破壁方法提取得到的总油脂及DHA产量，结果表明酶法是最优破壁方法.继而探讨不同单一酶破壁的总油脂产量，并将破壁效果最好的碱性蛋白酶和其他酶进行比较，确定最佳用酶为碱性蛋白酶.为进一步完善酶法破碎裂殖壶菌细胞的效果以提高总油脂产量，对碱性蛋白酶酶解的温度、pH、时间以及酶用量等条件进行优化.正交试验结果表明，碱性蛋白酶最佳酶解条件为酶用量2.0%，温度55 ℃，pH 10.0，酶解时间2.0 h.在此优化条件下，裂殖壶菌菌株FJU-512的每克菌体细胞总油脂产量达到0.458 6 g.

关键词：裂殖壶菌；提取；油脂；酶法破壁

二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)是一种重要的ω-3系列长链多不饱和脂肪酸，在人类大脑皮层、视网膜、睾丸以及精子中含量很高，是大脑结构脂肪酸不可或缺的成分之一[1-2]，具有增强记忆力、提高智力、降低血压和血脂、预防老年痴呆[3-4]、延缓衰老[5]等功能，是一种重要的功能保健因子.

裂殖壶菌(Schizochytrium)是一类单细胞海洋真菌，是目前商业化生产DHA的菌种之一，其安全性已经得到美国食品和药品部(FDA)的认可，可广泛应用于婴幼儿配方食品、孕期和哺乳期妇女食品及功能性食品[6].裂殖壶菌菌株FJU-512是本实验室分离获得的一株具独立知识产权的DHA 高产菌株[7]，该菌株生长速度较快，脂肪酸组成简单，DHA 含量高且易纯化[8]，可作为DHA油脂相关研究的优势菌株.DHA主要以甘油酯的形式存在于裂殖壶菌细胞内，为了获取胞内油脂，首先需进行裂殖壶菌细胞破壁.不同的细胞破碎方法直接影响DHA的产量、质量和生产成本，因此选取一种合适的细胞破壁工艺对工业化生产DHA尤为重要[9-10].目前在DHA的实际生产中，主要采用高压匀质等技术进行细胞破壁以释放胞内油脂，但高压匀质单次破壁效果差，须进行多次重复操作，易造成匀质机损耗严重，影响大规模连续作业[11].

本研究选取多种不同的细胞破壁方法，通过对比总油脂产量并权衡实际工业生产的可操作性，确定裂殖壶菌的最适破壁方法，优化破壁工艺条件，以期为DHA的工业化生产提供一定的技术支持.

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种

裂殖壶菌菌株FJU-512由本课题组保存，菌粉来源：15 L发酵罐发酵后收取菌液，6 000 r/min离心取菌体沉淀，-80 ℃冻干菌体即得菌粉.

1.1.2试剂

氢氧化钠、碳酸钠、盐酸、乙醇、正己烷：国药集团化学试剂有限公司，分析纯；碱性蛋白酶(比酶活≥200 U/mg)、中性蛋白酶(比酶活≥100 U/mg)、纤维素酶(比酶活≥30 U/mg)、β-葡聚糖酶(比酶活≥3 000 U/mg)：Ruibio公司.

1.1.3仪器

高压灭菌锅：上海博迅实业有限公司；双层全控温摇床：上海智诚分析仪器有限公司；高速台式冷冻离心机：Beckman Coulter公司；紫外分光光度计：Amersham Bioscience公司；循环水多用真空泵：郑州长城工贸有限公司；恒温培养箱：上海智诚分析仪器有限公司；超级恒温水槽：上海一恒科技有限公司；冻干机：Labconco公司，FreeZone系列.

1.2方法

1.2.1细胞破壁

1) 酸热法：取1 g裂殖壶菌菌粉于10 mL离心管，加入3 mL 30%(质量分数)的浓盐酸，重悬菌体，80 ℃恒温水浴1.0 h.

2) 碱热法：取1 g裂殖壶菌菌粉于10 mL离心管，加入3 mL pH 10.0的复合碱液(n(氢氧化钠)∶n(碳酸钠)=10∶1)，80 ℃恒温水浴2.0 h.

3) 超声波法：取1 g裂殖壶菌菌粉于10 mL离心管，加入3 mL单蒸水重悬菌体，置于400 Hz下超声4 s，间隔4 s，持续1.0 h.

4) 酶法：取1 g裂殖壶菌菌粉于10 mL离心管，加入3 mL pH已调为10.0的单蒸水重悬菌体，酶用量2.0%(占菌体干质量的百分比，下同)，50 ℃恒温水浴酶解2.0 h.

1.2.2油脂提取

破壁待冷却后加0.75 mL无水乙醇与2 mL正己烷，充分摇匀，1 200 r/min离心2 min，萃取油脂，取上清于已知质量的螺口管中.重复3次，充分萃取油脂.将螺口瓶置于干燥器中真空过夜抽干即得油脂，再次称得的质量减去螺口管质量即为油脂质量.

2结果与分析

2.1不同破壁方法对油脂提取的影响

以裂殖壶菌菌株FJU-512菌粉为材料，采用4种不同的细胞破壁方法(酸热法、碱热法、超声波法、酶法)对其进行破壁，各种破壁方法获得的总油脂及DHA产量如图1所示.其中酶法和碱热法效果最好，每克菌体细胞总油脂产量分别达到0.453 5和0.446 6 g，其次为酸热法0.426 9 g，而超声波法破壁效果相对较差，仅0.399 6 g.酶法作用条件温和、高效、低能耗，且能确保内含物成分破坏最小；另外，目前工业酶价格低廉且易得，因此确定裂殖壶菌最佳破壁方法为酶法.

图1　不同的细胞破壁方法获得的总油脂及DHA产量Fig.1Effects of different cell disruption methods on total lipid and DHA yields

2.2不同种类酶对油脂提取的影响

选用碱性蛋白酶、纤维素酶、中性蛋白酶和β-葡聚糖酶作为破壁试验用酶，分别考察不同酶对裂殖壶菌细胞破壁的效果，各酶用量均为2.0%，且均依据各自产品说明书的条件下酶解2.0 h.不同种类酶处理获取的总油脂量见图2.

图2　不同种类酶处理获取的总油脂产量Fig.2Effects of different enzymes on total lipid yields

如图2所示，碱性蛋白酶破壁效果最好，用其破壁所得的总油脂产量最高，其他几种酶的破壁效果依次为中性蛋白酶>纤维素酶>β-葡聚糖酶.碱性蛋白酶的作用位点在羧基侧富含芳香氨基酸(如酪氨酸和苯丙氨酸)或者疏水性氨基酸(如丙氨酸和亮氨酸)构成的肽键[12-13]，所以比中性蛋白酶和酸性蛋白酶的水解能力更强；同时还具有水解酯键、酰胺键和转酯化甚至转肽的功能.碱性蛋白酶的这些特性使其可以将复杂的大分子蛋白质结构降解成低分子质量的小分子肽链或者氨基酸；其另一种功能可能与部分破坏蛋白质结构有关，可使蛋白质组分变得易于吸收或洗去.目前工业上应用最广的也是碱性蛋白酶，因此本研究选取碱性蛋白酶作为试验用酶.

2.3碱性蛋白酶酶解条件的单因素试验

2.3.1酶解温度的影响

酶的化学成分为蛋白质，温度对其生物催化活性至关重要，根据碱性蛋白酶的性质，选取45～65 ℃温度区间考察.称取1 g裂殖壶菌菌粉于10 mL离心管，加入3 mL pH已调为10.0的单蒸水重悬菌体，酶用量2.0%，恒温水浴酶解2.0 h，考察不同酶解温度对总油脂产量的影响，结果如图3所示.

图3　酶解温度对总油脂产量的影响Fig.3Effect of enzymatic temperature on total lipid yield

由图3可知：随着温度的升高，裂殖壶菌总油脂产量先升后降，在55 ℃时总油脂产量最高，则可知在此温度下，酶的催化活性最高，细胞破壁效果最好；而当温度超过55 ℃时总油脂产量下降，可能是因为温度过高部分酶已经开始失活.因此选取正交试验的温度范围为50～60 ℃.

2.3.2酶解pH的影响

除温度外，pH条件对酶的催化效果也有较大影响，pH的偏移会导致酶活性部位结构的改变而影响其活性.根据碱性蛋白酶的最适pH范围，选取pH 8.5～10.5区间考察其对总油脂产量的影响，酶解温度为55 ℃，裂殖壶菌菌粉量、酶解时间以及酶用量同上，结果如图4所示.

图4　酶解pH对总油脂产量的影响Fig.4Effect of enzymatic pH on total lipid yield

由图4可知：裂殖壶菌总油脂产量随着pH升高先增加后降低，在pH为9.5时达到最高，可知该酶的最适pH为9.5，pH偏高或偏低都不易使酶发挥好的催化效果.因此选取正交试验的pH范围为9.0～10.0.

2.3.3酶解时间的影响

一般酶解时间越长，细胞破壁效果越好，总油脂产量也会越高.但酶解反应时间过长会导致胞内其他共溶物质逐步渗出，从而增加后期DHA分离的难度；同时过长的时间在实际生产中也需要相应增加能耗成本.因此选取1.5～3.5 h时间区域进行考察，酶解温度为55 ℃，酶解pH为9.5，裂殖壶菌菌粉量和酶用量同上，结果如图5所示.

图5　酶解时间对总油脂产量的影响Fig.5Effect of enzymatic time on total lipid yield

由图5可知：碱性蛋白酶在最佳酶解温度和pH条件下，总油脂产量得到一定的提高且相对稳定，在酶解2.0和3.5 h后达到2个高峰，基于后期DHA分离难度和能耗成本考虑，选取正交试验的酶解时间范围为1.5～2.5 h.

2.3.4酶用量的影响

酶用量的多少与底物的浓度存在一定的联系，偏少时细胞破壁不彻底，偏多又可能造成产物抑制而影响酶的活性，因此选择适宜的酶用量尤为重要.在酶用量为1.0%～3.0%，温度为55 ℃，pH为9.5的条件下酶解2.0 h，考察不同酶用量对总油脂产量的影响，结果如图6所示.

图6　酶用量对总油脂提取量的影响Fig.6 Effect of enzyme dosage on total lipid yield

由图6可知：随着酶用量的增加，总油脂产量逐渐增加，在2.0%的酶用量下达到最高，随后酶用量再增加，总油脂产量则逐渐减少.由此可知，在破碎裂殖壶菌细胞时，碱性蛋白酶的最佳酶用量为2.0%，此时底物与酶能最有效地结合，破壁效果最好，因此选取正交试验的酶用量范围为1.5%～2.5%.

2.4碱性蛋白酶酶解条件的正交试验

以碱性蛋白酶为试验用酶，总油脂产量为试验指标，设计4因素3水平 L9(34)正交试验(表1)，对酶解温度、pH、时间及酶用量进行优化，以确定最佳酶解条件，结果见表2，方差分析结果见表3.

表1　正交试验因素水平表Tab.1　Factors and levels of the orthogonal test

由表3可知，因素A(温度)、因素B(pH)、因素C(时间)、因素D(酶用量)对结果影响的显著程度依次为B>A>D>C，综合各个因素的k值可得，正交试验理论最优酶解条件为A2B3C2D2，即温度55 ℃，pH 10.0，酶解时间2.0 h，酶用量为2.0%.

2.5碱性蛋白酶酶解条件的重复验证实验

为了验证正交试验的准确性和有效性，将正交试验获得的最佳酶解条件进行重复实验，通过3组平行实验(总油脂产量分别为0.459 1，0.458 5和0.458 3 g)得出裂殖壶菌菌株FJU-512平均总油脂产量为0.458 6 g.使用优化的酶解破壁方法，总油脂产量分别比酸热法高7.42%，比碱热法高2.69%，比超声波法高14.76%.

表2　正交试验结果Tab.2　Result of the orthogonal test

注：k表示各水平的总和，R表示极差.

表3　方差分析结果Tab.3　Variance analysis of the orthogonal test

注：r2=0.926 99.

3讨论与结论

裂殖壶菌细胞破壁的方法多样，具有各自的特点和优点，且其工艺也日趋成熟，但仍然存在诸如能耗高、耗时长、反应条件剧烈造成部分DHA氧化等问题.为优化破碎工艺，本研究以裂殖壶菌菌株FJU-512为材料，首先对4种细胞破壁方法提取油脂的效果进行了比较，发现其中酶法和碱热法提取的油脂产量均较高且操作简单，而酸热法和超声波法提取的油脂产量略低.就工业化而言，超声法对设备要求较高，而碱热法和酸热法若大规模应用则更为耗能.综合上述条件，选用酶法作为裂殖壶菌破壁的方法.

进一步对酶法破壁工艺进行优化.通过比较确定最佳用酶为碱性蛋白酶，进而设计4因素3水平L9(34)正交试验，确定碱性蛋白酶酶解的最适条件为温度55 ℃，pH 10.0，酶解时间2.0 h，酶用量2.0%.通过重复验证得到裂殖壶菌菌株FJU-512的每克菌体细胞总油脂产量为0.458 6 g，证实了最佳酶解条件的优越性.

随着工业化设备的配套和生产工艺的发展，酶法作为一种高效、经济的油脂提取方法将为油脂的工业生产打开一个新局面，本研究也为后续有针对性地分离纯化DHA的工艺奠定了基础.

参考文献：

[1]张明亮,江贤章,余清梅,等.高密度流加放大培养Schizochytriumsp. FJU-512 生产DHA[J].药物生物技术,2013,20(1):34-38.

[2]SIMOPOULOS A P.Omega-3-fatty-acids in health and disease and in growth and development[J].The American Journal of Clinical Nutrition,1991,54(3):438-463.

[3]MEADUS W J,DUFF P,ROLLAND D,et al.Feeding docosahexaenoic acid to pigs reduces blood triglycerides and induces gene expression for fat oxidation[J].Canadian Journal of Animal Science,2011,91(4):601-612.

[4]WILLIAMS K W,SCOTT M M,ELMQUIST J K.From observation to experimentation:leptin action in the mediobasal hypothalamus[J].The American Journal of Clinical Nutrition,2009,89(3):985S-990S.

[5]UNDURTI N,DAS M D.Metabolic syndrome pathophy-siology:the role of essential fatty acids[M].New Jersey:Wiley-Blackwell,2010:201.

[6]林杰.裂殖壶菌粉碱热法破壁提取其胞内油脂[J].广州化工,2012,40(18):54-56.

[7]黄建忠,江贤章.DHA高产菌Schizochytriumsp.FJU-512 的分离及其18S rRNA 基因序列比较分析[J].应用与环境生物学报,2005,11(2):202-207.

[8]张娟梅，江贤章，黄建忠.裂殖壶菌Schizochytriumsp.FJU-512细胞油脂的研究[J].福建师范大学学报(自然科学版),2007,23(2):75-80.

[9]DALGAARD P.Qualitative and quantitative characterization of spoilage bacterium from packed fish[J].International Journal of Food Microbiology,1995,26(3):319-333.

[10]朱婧瑶,张红漫,胡耀池,等.面向工业化的裂殖壶菌DHA油脂提取方法研究[J].食品科技,2001,36(9):32-40.

[11]姜易彤,罗玮,王申强,等.高压均质与酶法相结合破碎裂殖壶菌[J].食品工业,2013,34(3):91-94.

[12]郝建华,王跃军,刘均忠,等.海洋活性酵母 YS-185 破壁技术的研究[J].湖南农业科学,2011(19):89-91.

[13]MATSUMOTO K,MATSUSAKI H,TAGUCHI K,et al.Isolation and characterization of polyhydroxyalkanoates inclusions and their associated proteins inPseudomonassp.61-63[J].Biomacromolecules,2002,3(4):787-792.

doi：10.6043/j.issn.0438-0479.201511012

收稿日期：2015-11-10录用日期：2016-02-23

基金项目：福建省自然科学基金重大项目(2011H6007)；福建省自然科学基金(2009J05057)；福建省科技重大专项(2010NZ0001-4)；福建省发改委产业化专项(闽财指[2010]358号)；福建省科技创新平台项目(2014Y2008)

*通信作者：hwsql@126.com

中图分类号:TQ 920.6

文献标志码：A

文章编号：0438-0479(2016)04-0606-05

Lipid Extraction of Schizochytrium sp. FJU-512 by Different Wall-breaking Processes

HE Wensheng1,2*,WANG Can2，YANG Shiying2

(1.Fujian Vocational College of Bio-engineering,Fuzhou 350002,China;2.National and Local Joint Engineering Research Center of Industrial Microbial Fermentation Technology,School of Life Science,Fujian Normal University,Fuzhou 350117,China)

Abstract:As one of the high-yield strains for DHA,Schizochytrium is currently used in commercial production of DHA.Therefore,cell disruption is an important process in the industrialized extraction for DHA.In this study,the effects of different cell disruption methods,such as acid-heating extraction,base-heating extraction,ultrasonic extraction and enzymatic extraction,on the extraction of single cell lipid of Schizochytrium sp.FJU-512 were demonstrated.Results indicated that enzymatic extraction was more effective than other three methods.Furthermore,the influence of different kinds of enzymes on lipid extraction was examined.It was found that the alkaline protease was the most effective enzyme according to the result of cell crushing.To further improve the yield of total lipid extraction,orthogonal test was applied to optimize the enzymatic hydrolysis conditions.The optimal condition was as follows:enzyme dosage of 2.0% cell mass,incubation at 55 ℃,pH 10.0 for 2.0 h,under which the highest total lipid yield could be achieved,up to 0.458 6 g per gram cells.

Key words:Schizochytrium;extraction;lipid;enzymatic disruption

引文格式：何文胜，王灿，杨诗颖.裂殖壶菌菌株FJU-512油脂提取的细胞破壁工艺[J].厦门大学学报(自然科学版)，2016,55(4)：606-610.

Citation：HE W S, WANG C，YANG S Y．Lipid extraction ofSchizochytriumsp. FJU-512 by different wall-breaking processes[J].Journal of Xiamen University(Natural Science)，2016,55(4)：606-610．(in Chinese)