液相色谱-串联质谱内标法测定牛奶中三聚氰胺的不确定度分析*

李研东，李肖莉，金世清，王振来，韩 雪（.河北省兽药监察所，石家庄 050035；.河北科技大学，石家庄 050000）



液相色谱-串联质谱内标法测定牛奶中三聚氰胺的不确定度分析*

李研东1，李肖莉1，金世清1，王振来1，韩 雪2
（1.河北省兽药监察所，石家庄 050035；2.河北科技大学，石家庄 050000）

摘 要：根据国家标准GB/T 22388-2008第二法，采用超高效液相色谱-串联质谱内标法测定了牛奶中三聚氰胺含量，对整个测量过程的不确定度来源进行了分析，并对不确定度各分量进行了评定和合成。结果显示，重复性测量不确定度分量对总不确定度的影响不明显。因此，该实验室牛奶中三聚氰胺含量的内标测定方法准确性较高，达到国家相关标准规定的要求。

关键词：牛奶中三聚氰胺 液相色谱-串联质谱 内标法 测量不确定度

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱串联质谱仪：Acquicy UPLC Xevo Tq-S，美国Waters公司；三聚氰胺标准品：纯度大于99%；三聚氰胺内标：纯度大于99%；固相萃取净化柱：MCX型，美国Waters公司；电子分析天平：BP221S型，感量0.1 mg，德国Sartorius公司；电子天平：JJ2000型，感量0.01 g，上海精密科学仪器有限公司。

乙腈使用色谱纯乙腈，默克公司；水使用超纯水，屈臣氏公司。乙酸铵、三氯乙酸使用分析纯试剂。

1.2 测量方法

试样用三氯乙酸溶液一乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用液相色谱-串联质谱法进行测定，内标法定量。测定步骤见图1。

2 数学模型

待测样品中三聚氰胺含量按公式计算（1）：

式中：X——待测样品中三聚氰胺含量，mg/kg；

c——待测样品中三聚氰胺浓度，μg/L；

V——待测样品最终定容体积，ml；

m——样品质量，g；

f——稀释倍数。

引入内标校准因子进行计算（2）：

式中：A1——标准中三聚氰胺内标峰面积；

A2——三聚氰胺标准对照品峰面积；

d2——标准中内标液浓度；

d1——三聚氰胺标准液浓度；

3 识别和分析不确定度来源

LC-MS/MS内标法测定三聚氰胺含量，其不确定度的来源包括以下几个方面：（1）重复性测定引入的不确定度。（2）检测方法引入的不确定度。（3）标准（内、外标）工作溶液引入的不确定度：包括标准样品引入的不确定度、标准样品称量引人的不确定度、标准工作溶液配制引入的不确定度、标准溶液添加引入的不确定度。（4）待测样品溶液定容体积引入的不确定度。（5）待测样品称量引入的不确定度。（6）其它不确定度来源。充分考虑所有不确定度贡献因素。

图1 三聚氰胺测定过程

4 测量不确定度评定

4.1 重复测定引入的不确定度评定

实验按照标准对同一牛奶样品中的三聚氰胺采取10次平行测定，测定结果见表1。

计算重复性测量不确定度：

相对不确定度：

1.2 检测方法引入的不确定度评定

通过测定加标样品回收率的偏差分析来进行方法引入的不确定度评定。回收率结果见表2。

结果计算了20个样品的平均回收率为90%，回收率标准偏差为16%。标准不确定度采用平均值的标准偏差：

检测统计数据t用下式来计算：

这个数据与95%置信度，n-1自由度的双边临界值tcrit比较（其中n=20是用来评估（Rec的测试结果的数目），t大于或等于tcrit值，说明Rec与1有显著性差异。

4.3 标准工作溶液引入的标准不确定度。

标准溶液不确定度主要由标准品的纯度和标准液移取、稀释和定容等操作引起。

4.3.1 三聚氰胺标准品（内标）的纯度

4.3.2 标准样品称量引入的相对标准不确定度

用准确至0.1 mg的电子分析天平称取100 mg三聚氰胺标准品，不确定度主要由环境、天平校准、称量线性所产生。固体称量受环境影响一般可忽略，而称量线性在重复性中已经评定，因此称量过程中所引入的不确定度来自天平校准。天平最大误差为0.1 mg，两次减量法称量引入的不确定度属于B类不确定度。按均匀分布处理，其标准不确定度为：

标准样品称量引入的相对标准不确定度：

4.4 标准溶液配制引入的标准不确定度

标准工作溶液引入的相对标准不确定度为：

内标与外标纯度一致，配置方法一致，所以内标引入的相对标准不确定度也是0.01。

4.5 待测样品溶液定容引入的标准不确定度

该方法中待测样品溶液的最终定容体积为1.0 ml，1 ml A级移液管的最大误差为0.008 ml，按均匀分布处理，待测样品溶液定容引入的标准不确定为urel（V样）=0.004 6。

4.6 待测样品称量引入的不确定度

4.7 样品中加入内标溶液引入的不确定度

样品中加入内标溶液的测量不确定度与4.4的不确定度评定多了0.1 ml分度移液管的不确定度，少了一个10 ml容量瓶引起的不确定度，0.1 ml分度移液管容量允差为0.002 ml，经计算得urel（V0.1）=0.012，因此样品中加入内标溶液引入的不确定度为：

表1 样品中三聚氰胺测定的结果 　mg/kg

表2 加标样品测定的回收率结果

4.8 串联质谱仪引入的不确定度

4.9 其它不确定度因素：牛奶样品中三聚氰胺分布不均匀引入的不确定度

不均匀性是样品的一种基本属性，它体现了样品各特性量值存在的分散性。当这种分散性相对于特性量值测量的分散性可以忽略时，认为样品是均匀的。通过一个修正因子来反映的数学期望值应为1，但其不确定度却不为零。而奶样经过摇匀处理，使其不均匀性降到最小，通过重复性测量已经把不均匀性引入的不确定度包含在内，因此不再单独考虑。

5 合成不确定度

以上各不确定度分量互不相关，则三聚氰胺检测结果的相对不确定度为：

6 扩展不确定度与测定结果的表示

参考文献

［1］ GB/T 22388—2008 原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法

［2］ JJF 1059.1—2012测量不确定评定和表示

［3］ JJG 196—1990玻璃仪器检定规程

*资助项目：河北省科技计划项目（15277107D）；河北省自然科学基金（C2014208064）；河北省畜牧兽医局科技项目（2014-1-03）