乳腺癌超声光散射断层成像与缺氧诱导因子- 1α的相关性

牛司华，朱庆莉，姜玉新，朱家安，孝梦甦，游珊珊，周炜洵，肖　雨

1中国医学科学院　北京协和医学院　北京协和医院超声诊断科，北京 1007302北京大学人民医院超声科，北京 1000443中国医学科学院　北京协和医学院　北京协和医院病理科，北京 100730



·论著·

乳腺癌超声光散射断层成像与缺氧诱导因子- 1α的相关性

牛司华1，朱庆莉1，姜玉新1，朱家安2，孝梦甦1，游珊珊1，周炜洵3，肖雨3

1中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院超声诊断科，北京 1007302北京大学人民医院超声科，北京 1000443中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院病理科，北京 100730

摘要：目的探讨乳腺癌超声光散射断层成像(US-DOT)与缺氧诱导因子- 1α(HIF- 1α)的相关性。方法对2007年10月至2010年2月在北京协和医院行手术切除、经病理证实、术前行US-DOT的69例原发性乳腺癌组织切片行HIF- 1α、CD34免疫组织化学染色，分析HIF- 1α阳性组和阴性组微血管密度(MVD)与US-DOT总血红蛋白浓度(THC)的差异。结果69例中，HIF- 1α阳性病例12例(17.4%)，平均THC(274.763±77.661)μmol/L，平均MVD(33.8±10.8)个/0.2 mm2；HIF- 1α阴性病例57例(82.6%)，平均THC(228.059±65.760)μmol/L，平均MVD(28.4±7.4)个/0.2 mm2；HIF- 1α阳性组的MVD(t=2.049，P=0.04)和THC(t=2.167，P=0.034)均显著高于HIF- 1α阴性组。结论HIF- 1α可以促进肿瘤血管生成，使肿瘤内血供增加，THC增加。作为反映肿瘤血供的指标，THC可间接反映肿瘤的血管生成活性。

关键词：乳腺癌；超声光散射断层成像；总血红蛋白浓度；缺氧诱导因子- 1α

ActaAcadMedSin，2016,38(3)：341-345

超声光散射断层成像(ultrasound-guided diffuse optical tomography，US-DOT)是在超声定位下，利用近红外光来探测组织的光吸收和散射特性，以获取组织的生理、生化及结构等信息的光学成像技术[1]。氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白是近红外光的主要吸收体，所测量指标总血红蛋白浓度(total hemoglobin concentration，THC)在乳腺良恶性疾病间有明显统计学差异[1- 2]，可以为乳腺疾病诊断提供更多信息。研究发现，THC与微血管密度(microvessel density，MVD)呈直线相关，因此可以用THC来反映肿瘤内血管生成[3- 4]。

肿瘤血管生成是一个复杂的过程[5]，血管生成因子众多，其中缺氧诱导因子- 1α(hypoxia-inducible factor- 1α，HIF- 1α)是缺氧条件下重要的调节因子[6]，在肿瘤血管生成过程中起重要作用。本研究对乳腺癌组织切片行HIF- 1α、CD34免疫组织化学染色，用CD34标记MVD，分析了HIF- 1α与MVD及THC的相关性，以期更好地理解THC值产生的病理学基础及临床意义。

对象和方法

对象2007年10月至2010年2月在北京协和医院进行手术切除、经病理证实、术前行US-DOT的女性原发性乳腺癌患者69例，平均年龄(53.1±10.2)岁(30～79岁)，均为单发浸润性导管癌，术前均未行放化疗。其中，左乳38例(55.1%)，右乳31例(44.9%)，病灶平均大小(2.56±1.00)cm(0.8～4.5 cm)。

US-DOT常规超声检查采用PHILIPS IU22、GE Logiq7超声诊断仪，实时线阵高频探头，频率5～13 MHz。US-DOT采用OPTIMUS Ⅱ型乳腺诊断仪(新奥博为，中国)，由超声诊断装置(Terason T3000，线阵探头频率7～12 MHz，Teratech，美国)和光散射断层成像系统组成的双模式成像系统。超声定位肿瘤后，光散射断层成像系统发射近红外光(785和830 nm)对组织进行扫描，得到组织在不同深度的光吸收和散射信息，从而提供THC和功能成像图。在光散射断层图像中，用彩色编码不同的吸收强度，颜色偏向红色表示光子吸收越多，组织血红蛋白浓度越高；颜色偏向蓝色表示光子吸收越少，组织血红蛋白浓度越低。

试剂一抗：兔抗人HIF- 1α单克隆抗体(货号：2015- 1，美国Epitomics公司)，鼠抗人CD34单克隆抗体(货号：M7165，丹麦DAKO公司)。二抗：酶标羊抗小鼠/兔lgG聚合物(货号：PV6000，北京中杉生物技术有限公司)。

染色方法所有手术切除标本均经10%甲醛溶液固定，常规组织处理。石蜡包埋，4 μm连续切片，60℃烘烤过夜，分别行HE和免疫组织化学染色。CD34免疫组织化学染色以典型阳性病例作为阳性对照，并做预实验。HIF- 1α用胃腺癌病例试染并进行浓度调试。最终，CD34抗体工作浓度为1∶50，HIF- 1α抗体工作浓度为1∶100。

CD34染色：脱蜡至水；PBS振洗5 min，2次；0.3%过氧化氢封闭30 min；PBS振洗5 min，2次；高压修复：在pH值为6的柠檬酸液中用高压锅冒气后加阀至最高压力持续2 min；PBS振洗5 min，2次；擦干周围液体滴加一抗(1∶50)4 ℃过夜；从冰箱取出，恢复室温，PBS振洗5 min，2次；滴加二抗，室温孵育50 min，PBS振洗5 min，2次；DBA显色，在显微镜下观察终止显色；苏木素复染1 min，水洗；盐酸酒精分化2 s，水洗；氨水反蓝，水洗；脱水、二甲苯透明，树胶封片。

HIF- 1α染色：脱蜡至水；PBS振洗5 min，2次；微波、胰酶双修复；将切片放入柠檬酸液中微波加热至95 ℃，持续5 min，PBS振洗5 min，2次；加入0.5%～1%的胰酶10 min，PBS振洗5 min，2次；0.3%过氧化氢封闭30 min，PBS振洗5 min，2次；滴加兔单克隆抗体HIF- lα(工作浓度为1∶100)，4 ℃过夜；从冰箱取出，恢复室温，PBS振洗5 min，2次；滴加二抗，室温孵育50 min，PBS振洗5 min，2次；DBA显色，在显微镜下观察终止显色；苏木素复染1 min，水洗；盐酸酒精分化2 s，水洗；氨水反蓝，水洗；脱水、二甲苯透明，树胶封片。

评分标准

HIF- 1α染色评分标准：根据文献报道方法对HIF- 1α染色进行评分：(1)阴性：未检测到细胞核染色；(2)+：细胞核染色所占比例≤5%；(3)++：细胞核染色比例在5%～10%且为弱- 中等染色；(4)+++：细胞核染色比例在5%～10%且为强染色或染色比例在10%～30%且为弱染色[7]。将上述等级分为阴性(-/+)和阳性(++/+++)2组。

MVD计数方法：先用NanoZoomer 2.0数字切片扫描装置(日本滨松光子学株式会社)将CD34染色切片扫描成高分辨率数字切片，然后在屏幕分辨率为1366×768的电脑上读片。微血管计数采用文献中应用最广泛的Weidner等[8]的计数方法。在放大50倍时选择5个MVD最高的区域(即热点)，然后在放大200倍下选择整屏图像，面积为0.2 mm2，相当于显微镜放大400倍时1个视野的面积。任何能与临近的微血管、肿瘤细胞和其他结缔组织成分分界清晰的棕染的内皮细胞或内皮细胞簇被认为是单一、可计数的微血管。血管腔不作为定义微血管必需的结构，红细胞并不用于定义血管腔。分支结构被认为是单一的血管。

统计学处理采用SPSS 17.0统计软件包，计量资料以均数±标准差表示，样本中两个均数的比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

69例患者平均THC为(236.181±8.388)μmol/L(103.300～405.100 μmol/L)，平均MVD为(29.336±8.237)个/0.2 mm2(17.400～52.800个/0.2 mm2)。HIF- 1α阳性病例12例(17.4%)(图1)，平均THC为(274.763±77.661)μmol/L(148.130～405.100 μmol/L)，平均MVD为(33.8±10.8)个/0.2 mm2(21.8～52.8个/0.2 mm2)；HIF- 1α阴性病例57例(82.6%)(图2)，平均THC为(228.059±65.760)μmol/L(103.300～375.100 μmol/L)，平均MVD为(28.4±7.4)个/0.2 mm2(17.4～48.8个/0.2 mm2)；HIF- 1α阳性组的MVD(t=2.049，P=0.04)和THC(t=2.167，P=0.034)均显著高于HIF- 1α阴性组。

讨论

US-DOT是近年发展起来的一种功能成像技术，提供肿瘤代谢及功能方面的信息[9- 10]。THC作为反映肿瘤血供多少的指标，可以在术前对病灶进行无创评价。由于血管生成在肿瘤的发生发展过程中起至关重要的作用，因此研究US-DOT成像原理及THC产生的病理学基础对US-DOT更好地应用于临床具有重要意义。

THC：总血红蛋白浓度；HIF- 1α：缺氧诱导因子- 1α；MVD：微血管密度

THC：total hemoglobin concentration；HIF- 1α：hypoxia-inducible factor- 1α；MVD：microvessel density

A.灰阶超声显示病灶为不规则的低回声，肿瘤最大径4.2 cm；B.光吸收图，THC为405.1 μmol/L(光子吸收较多，光吸收图接近红棕色)；C. HIF- 1α染色阳性(棕褐色细胞为阳性细胞)(×200)；D.CD34染色标记MVD，平均MVD为52.6个/0.2 mm2(×400)

A.ultrasound showed a hypoechoic lesion with irregular shape，and the maximum diameter of the tumor was 4.2 cm；B.reconstructed optical absorption map of the lesion，the THC was 405.1 μmol/L(higher THC indicates more photon absorption with reconstructed optical absorption map close to red)；C. HIF- 1α staining was positive (sepia cell showed the positive cell)(×200)；D.the average MVD marked by CD34 was 52.6/0.2 mm2(×400)

图 1女，47岁，左乳浸润性导管癌

Fig 1An invasive ductal carcinoma in the left breast of a 47-year-old woman

A.灰阶超声显示病灶边界不清、形态不规则，最大径2.6 cm；B.光吸收图，THC为208.6 μmol/L(光子吸收较少，光吸收图呈黄-棕色)；C.HIF- 1α染色阴性(×200)；D.CD34染色标记MVD，平均MVD为26.2个/0.2 mm2(×400)

A.ultrasound showed a hypoechoic lesion with irregular shape and unclear boundary，and the maximum diameter of the tumor was 2.6 cm；B.reconstructed optical absorption map of the lesion，and the THC value was 208.6 μmol/L(lower THC indicates less photon absorption with reconstructed optical absorption map close to yellow-brown)；C.HIF- 1α staining was negative(×200)；D.the average MVD marked by CD34 was 26.2/0.2 mm2(×400)

图 2女，70岁，左乳浸润性导管癌

Fig 2An invasive ductal carcinoma in the left breast of a 70-year-old woman

目前已知的血管生成因子众多，研究显示HIF- 1α具有较强的促进血管生成的作用[6]。随着肿瘤的快速生长，细胞耗氧量增加，缺氧成为肿瘤内常见的现象。HIF- 1是缺氧条件下重要的调节因子，包括HIF- 1α和HIF- 1β两个亚单位。HIF- 1α是功能性亚单位，HIF- 1β是结构性亚单位，二者形成异质二聚体共同发挥作用，调节多种与肿瘤进展包括血管生成、抵抗细胞凋亡及转移有关的基因，在病理状态血管生成过程中起关键作用[11]。

在正常氧含量条件下，HIF- 1α可以经过泛素-蛋白酶体途径被迅速降解以至于检测不到或仅检测到非常低水平的蛋白含量[12]。在缺氧条件下，HIF- 1DNA结合活性、HIF- 1α和HIF- 1β水平均以指数倍增加[13]，HIF- 1α累积并向核内移位。HIF- 1α-VEGF轴是肿瘤血管生成的上游激活剂，通过激活VEGF基因转录，导致肿瘤结节内VEGF含量增加，VEGF与血管内皮细胞上的受体结合使血管生成增加[14]，MVD增高。本研究结果显示，HIF- 1α阳性组MVD明显高于阴性组，与上述理论一致。THC作为评价乳腺癌血供的指标，与其直接对应的是肿瘤组织内微血管的多少。Zhu等[9]研究显示，乳腺癌MVD与所测的THC呈直线相关。THC可作为血管生成的替代指标[3]。因此，HIF- 1α阳性组MVD较高，THC也较高。作为功能成像指标，THC从侧面反映了肿瘤内血管生成活性。

除HIF- 1α-VEGF轴之外，HIF- 1α还可以调节多种血管生成因子基因，如血管生成素、基质金属蛋白酶等，这些血管生成因子在乳腺癌血管生成中也起一定作用。HIF- 1α还可以激活促红细胞生成素基因的表达，使红细胞生成增加[15]，也是造成THC较高的原因之一。

文献报道乳腺癌THC均值多在220 μmol/L以上[1，16]，但本研究中HIF- 1α表达阳性者中仍有部分病例THC低于200 μmol/L，分析其原因可能是由于恶性肿瘤内血管具有高度不一致性，不仅大小不一，而且分布不均匀、走形不规则，部分甚至表现为畸形，出现螺旋状等异常分支结构[17]，以及由于肿瘤生长速度较快，肿瘤内部出现坏死区域等，这些原因均造成部分乳腺癌THC值的变异，出现跨度较大的测值。

US-DOT简便易行、无电离辐射，是一种非侵入性、敏感定量评价肿瘤血管分布的方法[18]，从侧面反映了肿瘤内血管生成活性的高低，并可作为乳腺癌化疗及靶向治疗的评估方法。随着分子影像学技术的发展，US-DOT将会得到更广泛的应用。

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通信作者：姜玉新电话： 010- 69155491，电子邮件：jiangyuxinxh@163.com

中图分类号:R445.1

文献标志码:A

文章编号：1000- 503X(2016)03- 0341- 05

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.03.018

Corresponding author：JIANG Yu-xinTel：010- 69155491，E-mail：jiangyuxinxh@163.com

(收稿日期：2016- 01- 29)

Correlation between Ultrasound-guided Diffuse Optical Tomography and Hypoxia-inducible Factor- 1α of Breast Cancer

NIU Si-hua1，ZHU Qing-li1，JIANG Yu-xin1，ZHU Jia-an2，XIAO Meng-su1，YOU Shan-shan1，ZHOU Wei-xun3，XIAO Yu3

1Department of Ultrasound，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China2Department of Ultrasound，Peking University People’s Hospital，Beijing，100044，China3Department of Pathology，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China

ABSTRACT：ObjectiveTo investigate the correlation between ultrasound-guided diffuse optical tomography (US-DOT) and hypoxia-inducible factor- 1α (HIF- 1α) of breast cancer. MethodsTotally 69 patients with pathologically confirmed breast cancer underwent preoperative conventional breast ultrasonography examinations and US-DOT at Peking Union Medical College Hospital From October 2007 to February 2010 were enrolled in this study.After surgery，immunohistochemical staining of HIF- 1α and CD34 were performed，and the differences of total hemoglobin concentration (THC) and microvessel density (MVD) between HIF- 1α positive and negative groups were analyzed. ResultsHIF- 1α was positive in 12 cases (17.4%) and negative in 57 cases (82.6%). The average THC and MVD of HIF- 1α-positive cases were (274.763±77.661) μmol/L and (33.8±10.8)/0.2 mm2 respectively. The average THC and MVD of HIF- 1α-negative cases were (228.059±65.760)μmol/L and (28.4±7.4)/0.2 mm2. MVD(t=2.049，P=0.04) and THC(t=2.167，P=0.034) of HIF- 1α-positive group were significantly higher than those of HIF- 1α-negative group. ConclusionsHIF- 1α can promote tumor angiogenesis and thus increase the blood supply and THC. As an indicator of tumor blood supply，THC can indirectly reflect the angiogenic activity of breast cancer.

Key words：beast cancer；ultrasound-guided diffuse optical tomography；total hemoglobin concentration；hypoxia-inducible factor- 1α