铁皮石斛原球茎多糖提取及脱蛋白工艺研究

张英洁，耿岩玲，王晓1，，刘峰

(1.山东师范大学生命科学学院，山东 济南250014；2.山东省分析测试中心，山东省中药质量控制技术重点实验室，山东 济南250014)



铁皮石斛原球茎多糖提取及脱蛋白工艺研究

张英洁1,2，耿岩玲2，王晓1，2，刘峰2

(1.山东师范大学生命科学学院，山东 济南250014；2.山东省分析测试中心，山东省中药质量控制技术重点实验室，山东 济南250014)

摘要：研究了铁皮石斛原球茎培养物中多糖提取工艺并进行了不同脱蛋白方法的比较。以提取温度、提取时间和料液比三因素进行正交实验，得到多糖最佳提取工艺为提取温度90 ℃、提取时间60 min、料液比1∶40(g/mL)，多糖提取率78.51%。通过一系列单因素实验和正交优化实验，分析比较Sevage法、盐酸法、三氯乙酸法和木瓜蛋白酶法脱蛋白工艺。结果显示，Sevage法第5次洗脱效果最好，多糖质量分数43.81 %，蛋白质质量分数9.67 %；盐酸在体积分数25 %时效果最好，多糖质量分数52.17 %，蛋白质质量分数为4.82 %；三氯乙酸质量浓度为0.03 g/mL时，多糖质量分数最高35.50%，蛋白质质量分数7.34 %；木瓜蛋白酶法反应时间90 min、温度70 ℃、酶含量30 U时，多糖质量分数85.01 %，蛋白质质量分数为5.89 %，效果最为理想。

关键词：铁皮石斛；多糖；提取；脱蛋白

铁皮石斛(DerdrobiumofficinaleKimura et Migo)，兰科(Orchidaceae)，石斛属(Dendrobium)，为亚热带附生型多年生草本植物，俗称黑节草。铁皮石斛是我国一种传统的名贵中药材，具备滋阴清热、益胃生津和润肺止咳等功效，列为九大仙草之首。常用于热病伤津、口干烦渴和病后虚热等多种病症，具有降血糖[1]、抗肿瘤[2]、抗疲劳[3]、抗氧化[4]、抗高血压[5]和免疫调节[6]的功效。

铁皮石斛中成分多种多样，有多糖、生物碱、菲类[7]和联苄类[8]、酚酸类[9]、氨基酸和微量元素[10]等，具有很好的生物活性[11]。其中多糖是其主要成分，在石斛中的质量分数高达 30 %以上。近些年，人们对多糖功效的认识不断提高，大量的研究表明铁皮石斛多糖具有较强的抗肿瘤生物活性。如今，人们越来越注重养生，鉴于多糖是提高免疫和抗肿瘤的活性成分，铁皮石斛的社会需求量也愈来愈大。由于长年毫无节制地采掘以及生存环境的破坏，使铁皮石斛自然资源日渐枯竭。然而铁皮石斛原球茎培养物的出现，可以有效地缓解铁皮石斛资源匮乏的现状，恰好可以代替铁皮石斛为人们所用，满足大量的社会需求。目前对铁皮石斛原球茎多糖脱蛋白工艺的研究较少，本实验优化了多糖提取工艺，研究比较了Sevage法、盐酸法、三氯乙酸法和木瓜蛋白酶法4种脱蛋白工艺，得出铁皮石斛原球茎培养物中多糖脱蛋白的最佳工艺，为扩大工业生产提供参考依据。

1实验部分

1.1实验材料与设备

铁皮石斛原球茎培养物(大连普瑞康生物技术有限公司)。所用试剂均为分析纯；无水乙醇、三氯乙酸以及浓盐酸(国药集团化学试剂有限公司)；氯仿和正丁醇(天津市富宇精细化工有限公司)；木瓜蛋白酶(Biosharp网站)。HH-S4数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)；SB-5200D超声波清洗机(宁新芝生物科技股份有限公司)；旋涡混合器XH-T(金坛市医疗仪器厂)；Genesys10S US-Vis (赛默飞世尔科技公司)；电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；80-Ⅱ医用离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司)。

1.2石斛多糖的测定

采用蒽酮-硫酸法，将浓硫酸加入糖中经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，其与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比。

准确称取0.2 g的蒽酮置于100 mL容量瓶中，加乙酸乙酯定容，摇匀；吸取250 mL于25 mL容量瓶中，定容，摇匀即得10 mg/mL的样液。吸取250 μL置于另一个25 mL的容量瓶中，定容，摇匀，得到100 μg/mL的葡萄糖标准溶液。

分别精密吸取100 μg/mL的葡萄糖标准溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、6.0 mL，定容至10 mL，分别各取2.0 mL依次加入0.5 mL蒽酮-乙酸乙酯，5 mL浓硫酸，震荡摇匀，立即置于水浴锅中沸水保温10 min，反应完全冷却至室温后用紫外分光光度计测吸光度值A(在620 nm下)。以吸光度x为横坐标，石斛多糖的质量浓度y(mg/mL)为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程Y=0.009x+0.007，R2=0.999。

1.3多糖提取工艺优化

准确称取适量石斛粉末，加入适量水，在一定温度下，水浴回流加热，抽滤，滤渣回收，重复操作，收集滤液，旋蒸浓缩至原来体积的1/10，加入约4倍体积的无水乙醇，使乙醇体积分数达到约80 %，加入过程中不断搅拌，静置24 h，下层析出沉淀物收集冻干，得到粗多糖提取物。

选择提取温度(A)、提取时间(B)和料液比(C)为主要因素，通过单因素水平实验后，确定正交实验因素水平取值，见表1。

表1　L9(33)正交实验因素水平表

1.4多糖脱蛋白工艺优化

准确称取1.0 g多糖提取物，于100 mL容量瓶中定容，得到质量浓度为0.01 g/mL多糖溶液，采用Sevage法、盐酸法、三氯乙酸法和木瓜蛋白酶法4种方法脱蛋白。

1.4.1Sevage法脱蛋白

参考赵俊凌等[12]齿瓣石斛脱蛋白的方法，配制氯仿∶正丁醇为4∶1 (V/V)的溶液作为Sevage法脱蛋白所用的溶液。取20 mL配好的0.01 g/mL铁皮石斛原球茎培养物多糖溶液放入分液漏斗中，按照4∶1(V/V)比例，加入Sevage溶液，在分液漏斗中充分混匀后，震荡60 min弃去下相溶液，上相溶液留在离心管中，转速3 500 r/min下离心5 min，取上清液再次洗脱，重复上述步骤，一共进行6次洗脱，各取上清液2 mL，测定总糖和蛋白质量分数。

1.4.2盐酸法脱蛋白

根据准确配制好的体积分数为5%、10%、15%、20%、25%、30% 6个梯度的盐酸，与上述多糖溶液按1∶1(V/V)比例混合，充分混匀后，震荡，静置过夜，然后转速3 500 r/min下离心5 min，取上清液2 mL，测定总糖和蛋白质质量分数。

1.4.3三氯乙酸法脱蛋白

精确称取0.1 、0.3、0.5 、0.7 、0.9 、1.1 g的三氯乙酸，放入10 mL容量瓶中，加水定容，准确配成质量浓度0.01、0.03、0.05、0.07、0.09、0.11 g/mL 6个梯度的TCA溶液，分别与铁皮石斛原球茎培养物多糖溶液按1∶1(V/V)比例混合，震荡混匀后，静置过夜，离心机3 500 r/min离心5 min，取上清液2 mL，计算其总糖和蛋白质质量分数。

1.4.4木瓜蛋白酶法脱蛋白

吸取已准确配好的0.01 g/mL多糖溶液2 mL于离心管中，加入一定量的木瓜蛋白酶，水浴酶解，待反应完全后置于水浴锅中沸水浴，酶灭活5 min，离心机3 500 r/min，离心5 min，取上清液2 mL，计算其糖和蛋白质质量分数。

选取反应时间(A)、反应温度(B)和木瓜蛋白酶用量(C)为主要因素，通过单因素实验得出水平取值，见表2。

表2　 L9(33)正交实验因素水平表

2结果与讨论

2.1多糖提取优化结果

根据提取温度、提取时间和料液比3个因素的水平取值做L9(33)正交实验，结果见表3，方差分析结果见表4。

表3　正交实验方案与结果

表4　方差分析结果

由正交实验结果可知，对石斛原球茎培养物中多糖提取影响大小为：提取时间大于提取温度大于料液比，最佳提取工艺条件为提取温度90 ℃、提取时间60 min、料液比1∶40(g/mL)。F检验结果表明，反应温度、反应时间和酶含量在所考察的范围内均不显著(表3)。根据优化得到的最佳提取工艺进行3次平行实验，结果测得多糖质量分数为78.51 %，高于各单因素和正交设计实验结果，因此所确定的最优提取工艺条件合理可行。

2.2Sevage法脱蛋白优化结果

用紫外分光光度仪在620 nm下测吸光度值，确定多糖含量，在595 nm下测吸光度值，确定蛋白质含量。结果见图1。

由图1可知，Sevage法脱蛋白一共洗脱6次，蛋白质质量分数先升高后降低，随着洗脱次数的增加，多糖质量分数也一直在升高，但第六次开始下降。第五次洗脱时，测定的铁皮石斛培养物中多糖的质量分数最高，为43.81 %，蛋白质质量分数为9.67 %，效果最佳。

图1　不同洗脱次数对多糖及蛋白质含量的影响Fig.1　Impact of different elution times on polysaccharide and protein content

2.3盐酸法脱蛋白优化结果

蒽酮-硫酸法测多糖质量分数，考马斯亮蓝法测蛋白质质量分数(见图2)。由图2可知，随着盐酸体积分数的提高，多糖质量分数随着盐酸体积分数的增加先升高后降低，而蛋白质质量分数一直呈降低趋势，盐酸体积分数为25 %时，多糖质量分数最高为52.17 %，蛋白质质量分数为4.82 %，效果最佳。

2.4三氯乙酸(TCA)法脱蛋白优化结果

据图3可知，随着三氯乙酸TCA质量浓度的升高，蛋白质质量分数呈降低趋势，多糖质量分数先增加后减少，TCA质量浓度为0.03 g/mL时，测定的铁皮石斛原球茎培养物中多糖的质量分数最高为35.50 %，蛋白质质量分数为7.34 %，效果较好。

图2　不同体积分数盐酸对多糖及蛋白质含量的影响Fig.2　Impact of different HCL concentrations on polysaccharide and protein content

图3　不同浓度TCA对多糖及蛋白质含量的影响Fig.3Impact of different TCA concentrations on polysaccharide and protein content

2.5木瓜蛋白酶法脱蛋白优化结果

根据反应时间、反应温度和木瓜蛋白酶用量3个因素的水平取值做L9(33)正交实验，结果见表5，方差分析结果见表6。

表5　正交实验方案与结果

表6　方差分析结果

由正交实验结果可知，对铁皮石斛原球茎培养物多糖脱蛋白影响大小为酶含量大于反应温度大于反应时间，最佳脱蛋白工艺条件为反应时间90 min，温度70 ℃、酶含量30 U。F检验结果表明，反应温度、反应时间和酶含量在所考察的范围内均不显著(表6)。根据优化得到的最佳提取工艺进行3次平行实验，结果测得多糖质量分数为85.01 %，高于各单因素和正交设计实验结果，同时蛋白质质量分数为5.89 %，最佳工艺条件合理可行。

3结论

实验结果显示，不同因素对提取率均有影响，以多糖得率为指标，确定最佳提取工艺条件为提取时间60 min、提取温度90 ℃、料液比1：40(g/mL)。通过一系列的单因素实验和正交优化实验，分析比较Sevag法、盐酸法、三氯乙酸法和木瓜蛋白酶法4种脱蛋白工艺。结果表明，Sevag法脱蛋白操作繁琐，步骤冗杂；酸法脱蛋白效果较好，但是盐酸污染严重；三氯乙酸法脱蛋白多糖损失较为严重；木瓜蛋白酶法脱蛋白效果比较明显，多糖损失较少，是一种较为理想的蛋白质脱除方法。

参考文献：

[1]张贝贝,刘文洪,李俊峰, 等．铁皮石斛多糖对高糖诱导的血管内皮细胞Bax、Bcl-2表达的影响[J].中国药理学通报, 2015, 31(1): 64-70．

[2]刘明昆, 李国庆. 石斛提取物抗肿瘤作用研究进展[J].现代医药卫生, 2015, 31(23): 3571-3574.

[3]吕圭源, 颜美秋, 陈素红. 铁皮石斛功效相关药理作用研究进展[J].中国中药杂志, 2013, 38(4): 489-493

[4]龚庆芳, 何金祥, 黄宁珍, 等. 铁皮石斛花化学成分及抗氧化活性研究[J].食品科技, 2014, 39(12): 106-110.

[5]吴人照, 杨兵勋, 李亚平. 铁皮石斛多糖对SHR-sp大鼠抗高血压中风作用的实验研究[J].中国中医药科技, 2011, 18(3):204-205.

[6]宋美芳, 李光, 陈曦, 等. 两种石斛多糖提高小鼠免疫活性的初步研究[J].中国药学杂志, 2013, 48(6): 428-431

[7]李榕生, 杨欣, 何平, 等. 铁皮石斛根茎中菲类化学成分分析[J].中药材, 2009, 32(2): 220-223.

[8]LI Y, WANG C L, WANG Y J, et al. Three new bibenzyl derivatives fromDendrobiumcandidum[J].Chem Pharm Bull, 2009, 57(2): 218-219.

[9]王芳菲, 李燕, 董海玲, 等. 铁皮石斛中一个新化合物[J].中国药学杂志, 2010, 45(12): 898-902.

[10]诸燕, 苑鹤, 李国栋, 等. 铁皮石斛中11种金属元素含量的研究[J].中国中药杂志, 2011, 36(3): 356-360.

[11]李娟, 李顺祥, 黄丹,等.铁皮石斛资源、化学成分及药理作用研究进展[J].科技导报. 2011, 29(18): 74-79.

[12]赵俊凌, 马洁, 李戈，等. 齿瓣石斛多糖提取及脱蛋白工艺研究[J].时珍国医国药, 2010, 21(11): 2841-2843.

DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.03.002

收稿日期：2016-03-22

基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)(2014AA022201-05)；山东省自然科学基金(ZR2014YL005)

作者简介：张英洁(1991-)，女，硕士研究生，研究方向为天然产物分离纯化。Email: 1009171097@qq.com *通讯作者，刘峰(1981-)，男，博士，助理研究员，研究方向为天然产物研究与开发。Email: liufeng8109@163.com

中图分类号：R284.2

文献标识码：A

文章编号：1002-4026(2016)03-0007-06

Extraction and deproteinization technology for polysaccharide fromDendrobiumofficinaleprotocorm

ZHANG Ying-jie1,2, GENG Yan-ling2, WANG Xiao1,2, LIU Feng2*

(1.School of Life Sciences, Shandong Normal University, Jinan 250014,China;2. Shandong Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Control Technology, Shandong Analysis and Test Center, Jinan 250014, China)

Abstract∶We addressed polysaccharide extraction technology from Dendrobium officinale protocorm and compared different deproteinization methods. We conducted orthogonal experiments with extraction temperature and time, and the ratio of solid and liquid as parameters. We found its optimum extraction conditions included extraction temperature of 90 ℃,extraction time of 60 minutes and solid/ liquid ratio of 1∶40 (g/mL), and extraction efficiency could reach 78.51 %. We further compared Sevage, hydrochloricacid (HCl), trichloroacetic acid (TCA) and papain deproteinization technologies through a series of single element experiments and orthogonal optimization experiments. Experimental results show that: the fifth elution effect of Sevage is optimal, polysaccharide content of 43.81% and protein content of 9.67%. Elution effect is optimal, polysaccharide content of 52.17% and protein content of 4.82%, when HCL concentration is 25%. When TCA concentration is 0.03 g/mL, polysaccharide content is 35.50 % and protein content is 7.34 %. For papain method, optimum extraction conditions are enzymolysis time of 90 min, temperature of 70 ℃, and enzyme content of 30 U. The corresponding best effect is polysaccharide content of 85.01% and protein content of 5.89%.

Key words∶Dendrobium officinale; polysaccharide; extraction; deproteinization

【中药与天然活性产物】