高速逆流色谱法连续分离制备小白菊内酯

孙兆林，闫慧娇，宫成玉，孙常磊，王岱杰，李佳，王志伟，王晓*

(1．山东省中药质量控制技术重点实验室，山东省分析测试中心，山东 济南 250014；2.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355;3.烟台出入境检验检疫局，山东 烟台　264000)



高速逆流色谱法连续分离制备小白菊内酯

孙兆林1,2，闫慧娇1，宫成玉3，孙常磊1,2，王岱杰1，李佳2，王志伟1，王晓1,2*

(1．山东省中药质量控制技术重点实验室，山东省分析测试中心，山东 济南 250014；2.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355;3.烟台出入境检验检疫局，山东 烟台264000)

摘要：高速逆流色谱法连续进样，分离制备杭白菊中的小白菊内酯。采用高速逆流色谱法进行分离，以正已烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶5∶6∶4，V/V)为溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，连续进样3次，浸膏进样量330、350、370 mg，转速800 r/min，流速2.0 mL/min，检测波长254 nm。从杭白菊超声提取物中，分离得到小白菊内酯5.0 、5.2 、5.5 mg，纯度分别为93.1%、92.6%、92.9%。利用连续进样的高速逆流色谱法，可高效分离和纯化杭白菊中的小白菊内酯。

关键词：高速逆流色谱；连续多次进样；杭白菊；小白菊内酯

图1　小白菊内酯的化学结构式Fig.1Chemical structure of parthenolid

菊花为菊科植物菊花(ChrysanthemummorifoliumRamat．)的头状干燥花序，具有散风清热、平肝明目和清热解毒之功效，用于治疗风热感冒、眼目昏花、头痛眩晕、目赤肿痛以及疮痈肿毒等证[1]。药理实验证明，菊花具有抗炎、杀菌、降压和治疗冠心病的作用，是卫生部新一批的药品和食品资源。按不同产地和加工方法，菊花分为杭菊、滁菊、毫菊、怀菊、贡菊和川菊等[2]。小白菊内酯(parthenolide)是一种倍半萜烯内酯化合物，最早从艾菊中纯化得到[3]，Hfptinstall等[4-6]的大量研究证据表明小白菊内酯具有抗氧化、抗凋亡以及抗炎等多种药理特性，并用以治疗银屑病、关节炎、偏头痛和发热等多种疾病。近几年，Zingarelli等[7-8]还报道小白菊内酯对心肌梗死再灌住后的心肌具有保护作用，对胰腺肿瘤也有一定的抑制作用。国内外大量文献研究表明，现阶段对于小白菊内酯的药理学研究较多，关于杭白菊的化学成分研究也只是局限于黄酮类化合物的研究[9]，尚未见到关于小白菊内酯的分离制备纯化研究。本文通过高速逆流连续分离制备的方法，实现了对杭白菊甲醇提取物中小白菊内酯的高效、快速的分离纯化，得到小白菊内酯(结构如图1所示)。该研究为小白菊内酯的药理学研究以及临床实验提供技术支撑。

1实验部分

1.1仪器与试剂

中药高速粉碎机(瑞安市永历制药机械制造有限公司)；3057-11记录仪(重庆川仪总厂有限公司)；高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司)；8823-B紫外检测器(北京宾达英创科技有限公司)；TBP5002泵(上海同田生物技术有限公司)；旋转蒸发仪(巩义市予华仪器有限公司)；超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；SHB-B95型循环水式多用真空泵(郑州长城科技工贸有限公司)；恒温循环器(郑州长城科技工贸有限公司)。Symmetry C18色谱柱(4.6 mm × 5 mm, 5 μm)，Waters 600-996高效液相色谱系统(美国Waters公司)。

乙腈为色谱纯(美国天地公司)；甲醇为分析纯(中国医药集团上海化学试剂公司)；实验用水为过滤蒸馏水及娃哈哈纯净水。

杭白菊药材购自山东中医药大学附属中鲁医院。经山东中医药大学李佳教授鉴定为菊科植物杭白菊(Chrysanthemummorifolium)的头状干燥花序。

1.2实验方法

1.2.1小白菊内酯粗提物的提取

将购买的杭白菊药材1 kg，用高速中药粉碎机粉碎成粉末状，先用甲醇浸泡24 h，料液比1∶10，超声提取15 min，抽滤，减压浓缩至浸膏状，得浸膏325.21 g。将少许提取物浸膏用甲醇溶解，HPLC检测分析。

1.2.2样品溶液和溶剂体系的配制

在2 000 mL分液漏斗中配制正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶5∶6∶4,V/V)溶剂体系，并充分摇匀，在室温下放置30 min。使用前分别取上相和下相，在超声震荡仪中脱气20 min，备用。

分别取330、350、370 mg小白菊内酯粗提物浸膏，分别取上下相溶剂各10 mL作为样品溶液，使样品完全溶于上下相溶剂，备用。

1.2.3HSCCC的分离制备过程

以20.0 mL/min的流速向高速逆流色谱仪的分离管中注入上相，15 min后，调整主机转速为800 r/min，记录仪衰减100 mV，纸速6.0 cm/h；检测器衰减2.0 A。同时以2.0 mL/min流速注入下相，打开紫外检测器，待下相从柱出口流出，两相达到动态平衡后，由进样阀注入样品溶液，检测波长254 nm，记录色谱图，根据色谱图接收目标成分。

1.2.4高效液相色谱分析条件

色谱柱：Symmetry C18柱(4.6 mm × 5 mm, 5 μm)，流动相为乙腈-水溶液，柱温为25 ℃，50%乙腈等度洗脱；流速为0.8 mL/min；进样量为10 μL;检测波长为254 nm。

2结果与讨论

2.1HSCCC溶剂体系的选择及优化

高速逆流色谱分离中溶剂体系的选择是非常重要的，溶剂体系符合与否是由目标化合物在两相溶剂中的分配系数(KD)来确定的。一般来说，对HSCCC最合适的KD值范围是0.5～2.0[10]。本实验中，目标产物存在于超声提取的甲醇部位，因此选用中极性的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系。本实验测定了目标化合物在不同体积比的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶剂体系中的KD值。实验结果表明，目标化合物可以在两相溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶5∶6∶4，V/V)时，达到分离的目的。目标化合物在不同体积比的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系中的KD见表1。体积比为5∶5∶4∶6和5∶5∶5∶5的体系虽然能获得较高的固定相保留率，但样品与杂质的分离度太小。体积比为5∶5∶6∶4的溶剂体系的KD值比较接近于1，最适合用于HSCCC 系统分离[11]。

表1杭白菊甲醇粗提物中小白菊内酯在不同体积比溶剂体系中的KD值

Table 1Partition coefficients (KD) of parthenolide in crude extract fromChrysanthemummorifolium

for different two-phase solvent systems

正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶剂体系(V/V)KD5∶5∶4∶646.025∶5∶5∶53.135∶5∶6∶41.05

2.2HSCCC分离纯化的结果

以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶5∶6∶4,V/V)为两相溶剂体系，按照1.2.3节所述的方法对杭白菊提取物进行分离纯化。分别将330、350、370 mg样品溶于20 mL等体积混合的上下相溶液中进行HSCCC分离(见图2)，根据图2中的阴影部分进行手动分段收集，得到目标化合物。将馏分减压浓缩干燥，其质量依次为5.0、5.2、5.5 mg。经过HPLC分析并应用面积归一法测定化合物的纯度分别为93.1%、92.6%和92.9%,分析结果见图3。

图2　杭白菊中小白菊内酯成分的高速逆流图谱Fig.2　HSCCC chromatogram of parthenolide from Chrysanthemum morifolium

a杭白菊甲醇提取物总样;b 小白菊内酯标准品;c HSCCC谱图中阴影部分图3　HPLC图谱Fig.3　HPLC chromatograms

2.3化合物的结构鉴定

白色片状结晶ESI-MSm/z: 248(M+), 230(M+-H2O), 190(M+-COOHCH2)。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 6.12 (1H, d,J= 3.1 Hz, H-13b), 5.79 (1H, d,J= 3.1 Hz, H-13a), 5.26 (1H, br,H-1), 4.06 (1H, t,J= 8.5 Hz, H-6), 2.90 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-5), 1.65 (3H, br s, Me-10), 1.20 (3H, s, Me-4)。13C-NMR (150 MHz, DMSO) δ: 169.7 (C-12), 140.5 (C-11), 135.0 (C-10), 124.9 (C-1), 121.1 (C-13), 82.6 (C-6), 65.7 (C-5), 61.7 (C-4), 46.9 (C-7), 36.4 (C-3), 30.0 (C-8), 24.1 (C-2), 17.3 (C-14),17.0 (C-15)。

综合该化合物的1H-NMR、13C-NMR数据，与文献[12-14]报道中的小白菊内酯相关数据基本一致，故鉴定化合物为小白菊内酯。

3结论

小白菊内酯具有广泛的药用价值，开展小白菊内酯的药效学等研究均需要高纯度的小白菊内酯，使得小白菊内酯快速高效的分离纯化技术需求愈加紧迫。本研究建立了HSCCC连续进样制备小白菊内酯的方法，所得样品纯度高，方法简便、快速且节省溶剂，具有较大的实用价值，为更好地开发利用小白菊内酯提供了技术支撑。

参考文献：

[1]国家药典委员会. 中华人民共和国药典2010版一部 [M].北京:中国医药科技出版社, 2010: 292.

[2]刘德军. 菊花[M].北京:中国中医药出版社, 2001: 65-77.

[3]周惠琼. 小白菊内酯的生物特性与药理作用研究进展[J].中国新药杂志. 2009, 18(20): 1954-1957.

[4]HFPTINSTALL S,AWANG D V C,DAWSON B A,et.al. Parthenolide content and bioactivity of feverfew(Tanacetumparthnium(L.) Schultzbip.).Estimation of commercial and authenticated fever few products[J].J Pharm Pharmacol,1992, 44(5): 391-395.

[5]HEINRICH M, ROBLES M, WEST J E, et al. Ethnopharmacology of Mexican asteraceae (compositae)[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol, 1998, 38:539-565.

[6]SCHINELLA G R, GINER R M, RECIO M C, et al. Anti-inflammatory effects of South American Tanacetum vulgare[J].Pharm Pharmacol. 1998,50(9):1069-1074

[7]ZINGARELLI B, HAKE P W, DENENBERG A, et al. Sesquiterpene Lactone parthenolide, an inhibitor of I kappaB kinase complex and nuclear factor-kappaB,exerts beneficial effects in myocardial reperfusion injury[J].Shock,2002,17(2):127-134.

[8]方梁杰, 周建英. 小白菊内酯在抗肿瘤中的作用及其机制研究进展[C]//2011年第三十三届浙江省呼吸系病学术年会暨呼吸疾病诊治新进展学习班论文汇编.浙江：[s.n.],2011：27-29.

[9]金建忠,闻名,申屠超. 杭白菊化学成分最新研究进展[J].食品工业科技, 2014, 15: 386-394.

[10]管仁军, 王岱杰, 于宗渊, 等. 高速逆流色谱分离纯化蔓荆子中的活性成分[J].色谱, 2010, 28(11): 1043-1047.

[11]李小多, 李学刚, 宋尚华, 等. 高速逆流色谱法快速分离制备枸杞中莨菪亭[J].色谱, 2012, 30(9):971-974.

[12]OGURA M, CORDELL G A ， FAMSWORTH N R. Anticancer sesquiterpene laetones ofMicheliacompressa(mdgnoliaceae)[J].Phytochemistry,1978, 17(5): 957-961.

[13]JACOBSSON U,KUMAR V,SAMINATHAN S. Sesquiterpene laetones fromMicheliachampaca[J].Phytochemistry, 1995, 39(4): 839-843.

[14]RUANGRUNGSI N,RIVEPIBOON A, LANGE G L, et al. Constituents of Paramihelia baillonii:A new antitumor germacranolide alkaloid[J].J Natural Products, 1987, 50(5):891-896.

DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.03.004

收稿日期：2015-12-10

基金项目：山东省自然科学基金三院联合基金(ZR2015YL012)；山东省科学院青年科学基金(2014QN005)

作者简介：孙兆林(1990-)，男，硕士研究生，研究方向为中药资源与质量控制。 *通讯作者，王晓(1972-)，男，研究员，博士，硕士生导师，研究方向为天然产物研究与开发。Email: wangx@sdas.org

中图分类号：R284.2

文献标识码：A

文章编号：1002-4026(2016)03-0018-05

Continuous separation and preparation of parthenolide fromChrysanthemummorifoliumwith high-speed counter-current chromatography

SUN Zhao-lin1,2,YAN Hui-jiao1,GONG Cheng-yu3,SUN Chang-lei1,2, WANG Dai-jie1,LI Jia2, WANG Zhi-wei1, WANG Xiao1,2*

(1. Shandong Provincial Key Laboratory of TCM Quality Control Technology, Shandong Analysis and Test Center, Jinan 250014, China;2. School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;3.Yantai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Yantai 264000,China)

Abstract∶We separated and prepared parthenolide from Chrysanthemum morifolium with continuous multiple preparation and high-speed counter-current chromatography (HSCCC). We acquired parthenolide of 5.0,5.2 and 5.5 mg from Chrysanthemum morifolium extract of 330,350 and 370 mg. Their purities were respectively 93.1%, 92.6%, and 92.9%. Experimental conditions were HSCCC, solvent system of n-hexane-ethyl acetate-methanol-water (5∶5∶6∶4, V/V), upper stationary phase and lower mobile phase, rotation speed of 800.0 r/min, flow rate of 2.0 mL/min and detection wavelength of 254 nm. It shows that continuous preparation HSCCC can efficiently separate and purify parthenolide from Chrysanthemum morifolium.

Key words∶high-speed counter-current chromatography; continuous multiple preparation; Chrysanthemum morifolium; parthenolide

【中药与天然活性产物】