乳制品生产过程中耐热菌分离鉴定与抑菌效果评价

王林林，何光华，储小军，李海龙，郝东海，林学海，刘福生

（1.贝因美婴童食品股份有限公司，杭州310007；2.浙江科技学院生物与化学工程学院，浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，杭州310023）

乳制品生产过程中耐热菌分离鉴定与抑菌效果评价

王林林1，何光华1，储小军1，李海龙1，郝东海1，林学海2，刘福生1

（1.贝因美婴童食品股份有限公司，杭州310007；2.浙江科技学院生物与化学工程学院，浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，杭州310023）

通过对乳制品生产过程中微生物易污染点进行耐热菌菌株分离鉴定；同时利用低聚果糖、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌作为抑菌物质对耐热菌进行抑菌作用效果观察。结果表明，地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌等耐热芽孢菌为奶制品生产中优势污染菌；原料为耐热菌重要污染来源之一。抑菌物质对耐热菌生长有一定的抑制效果，组合添加抑菌物质抑菌效果更佳；对于不同的耐热菌，有针对性选择抑菌物质能起到较好的抑菌效果。

乳制品；耐热菌；抑菌作用；芽孢菌

0 引言

乳制品生产过程中有些细菌能耐受传统的巴氏杀菌（72℃/15 s），甚至超高温杀菌（UHT，140～145℃/2～5 s）而存活下来，这些对热处理有耐受性质的细菌统称为耐热菌（thermoduric bacteria，TB）。耐热菌是指经常规工艺杀菌不能被杀死的一类微生物［1］，主要包括芽孢菌（Spore-forming bacillus），因其能形成耐热性芽孢，故杀菌处理后仍能残存在产品生产过程中或产品中。造成乳制品污染［2］。

已有研究表明利用益生菌、益生元对食品致病菌如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉等生长具有抑制效果［3-4］，但尚未有关于益生菌、益生元对耐热菌抑制作用相关报道。本文以乳制品生产过程中分离得到的耐热菌为抑制指示菌，选取低聚果糖、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌对其进行抑菌效果评价，为耐热菌控制提供参考方法。

1 材料与方法

1.1 菌种分离与鉴定

根据奶制品生产流程，对可能存在的微生物污染点进行样品或涂抹取样，将得到的取样样品使用平板计数琼脂（PCA）培养基参照GB4789.2的培养菌落总数方法进行培养［5］，再从PCA平板中分离得到芽孢形成菌。菌落通过染色镜检初步确定，随后被分离活化。分离的菌株经过16S rDNA全序列检测以鉴定其所属及种，再进行相关实验。

1.2 抑菌实验

1.2.1 材料

选取上述分离鉴定出的耐热菌作为指示菌，增殖并筛选菌液浓度均为105mL-1；益生元：低聚果糖（fructo oligosaccharide，FOS，添加浓度为10%），量子高科（中国）生物股份有限公司；益生菌：嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus，添加浓度107mL-1）和保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus，添加浓度108mL-1）均为实验室分离保藏菌株。

1.2.2 实验设计

配置培养基，溶解均匀，121℃灭菌15 min，取15 mL培养基倒入灭菌平皿内，冷却凝固；吸取调整浓度为105mL-1指示菌菌悬液1～5 mL与100 mL冷却至45℃的培养基混匀，然后每一平皿分别加入5 mL混合液，均匀摊布在底层具有培养基的平皿内，此时平板立刻进行抑菌试验。在水平放置的平皿中用镊子均匀地放置3只无菌牛津杯。吸取一定浓度的抑菌物质溶液或混合液200 μL于牛津杯中，42℃培养24 h，测定抑菌圈直径［6］。实验组分为：（a）.以保加利亚乳杆菌为抑菌物质单独添加；（b）.以嗜酸乳杆菌为抑菌物质单独添加；（c）.以FOS为抑菌物质单独添加；（d）.以保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌为抑菌物质混合添加；（e）.以保加利亚乳杆菌、FOS为抑菌物质混合添加；（f）.以嗜酸乳杆菌、FOS为抑菌物质混合添加；（g）.以保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、FOS为抑菌物质混合添加。

数据采用SPSS 19.0软件的ANOVA进行方差分析，Duncan法进行多重比较，各组数据以平均数±标准差（mean±SE）表示。

表1 不同样品来源菌株的分离鉴定

2 结果与分析

2.1 菌种分离鉴定

表1为不同样品来源菌株的分离鉴定结果。由表1可以看出，在奶制品生产过程中分离得到较多的耐热菌菌株包括地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌等一些乳制品生产中常见的芽孢菌［7］。

从来源上看，在生产的各个环节中均有芽孢菌的出现，可见在生产中芽孢菌能经受传统杀菌热处理而存活下来。其中从DSI设备中可分离得到地衣芽孢杆菌与张勇等［8］研究结果类似，该研究对5种不同品牌的UHT杀菌牛乳中残留的细菌进行了分离，得到18株细菌，并对它们进行了耐热性和细菌学鉴定试验，结果表明18株细菌全部耐热。

此外，从微生物分布情况来看，原料中分离出来的菌株种类较多，且随着生产过程进行，在奶制品生产的其他阶段，如混料、均质等，也出现相同菌种。以地衣芽孢杆菌为例，在原料中分离得到后，随着生产进行，在混料阶段、均质阶段、浓奶、DSI设备、成品中均可分离得到，这个现象表明这些芽孢菌可能存在一定关联性，可能是某一来源的污染菌随着生产进行最终污染产品。原因可能是乳制品生产中，有些耐热菌并没有经过热处理被杀死，而是随着生产流程进入管道。由于管道中乳制品营养较丰富，这些耐热菌会在生产管道中形成生物膜［9］，生物膜上附聚的耐热菌会随着生产流程进入下一阶段生产工段或半成品中。生物膜是微生物附着于生物或非生物表面，分泌黏性胞外基质（Extracellular Polymeric Substances，EPS）将其自身包裹其中，为适应环境而形成的高度组织化、自由化微菌落膜性聚集物。一般而言，微生物附着于物体表面后，逐渐形成菌群，随后依附环境条件形成生物膜，到一定阶段后将会有微生物从成熟的生物膜中释放出，对乳制品生产有不利影响［10］。

乳制品加工过程中耐热菌来源复杂，原料、周围环境、操作员工都有可能带入微生物造成污染，上述实验结果表明原料是耐热菌污染的重要源头之一，生产过程中其他来源的耐热菌同样存在随着生产流程最终流入成品的可能，因此找出污染源头对控制耐热菌污染有重要的参考意义。可以利用脉冲场凝胶电泳进行溯源分析［11］，明确污染源存在哪些地方进而采取控制措施，降低成品被耐热菌污染的程度。

2.2 抑菌结果与分析

2.2.1 抑菌实验结果

图1为实验结果。由图1可以看出，添加低聚果糖、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌作为抑菌物质对耐热菌均有抑制效果，其中抑菌物质组合添加比抑菌物质单独添加抑菌效果更好。

图1 抑菌物质对耐热菌抑制效果

2.2.2 以添加抑菌物质对每种耐热菌抑菌效果评价

（a）保加利亚乳杆菌抑菌效果如表2所示。

表2 添加保加利亚乳杆菌对5种耐热菌抑菌效果

从表2可以看出，保加利亚乳杆菌对5种耐热菌抑制效果从强到弱分别为蜡样芽胞杆菌＞枯草芽孢杆菌＞短小芽孢杆菌＞地衣芽孢杆菌＞A.flavithermus。

（b）嗜酸乳杆菌抑菌效果如表3所示。

表3 添加嗜酸乳杆菌对5种耐热菌抑菌效果

由表3可以看出，嗜酸乳杆菌对5种耐热菌抑制效果从强到弱分别为蜡样芽胞杆菌＞枯草芽孢杆菌＞地衣芽孢杆菌＞短小芽孢杆菌＞A.flavithermus。

（c）FOS抑菌效果如表4所示。

表4 添加FOS对5种耐热菌抑菌效果

由表4可以看出，FOS对5种耐热菌抑制效果从强到弱分别为短小芽孢杆菌＞地衣芽孢杆菌＞A.flavithermus＞枯草芽孢杆菌＞蜡样芽胞杆菌。

（d）保加利亚乳杆菌+嗜酸乳杆菌抑菌效果如表5所示。

表5 添加保加利亚乳杆菌+嗜酸乳杆菌对5种耐热菌抑菌效果

由表5可以看出，保加利亚乳杆菌+嗜酸乳杆菌混合添加对5种耐热菌抑制效果从强到弱分别为蜡样芽胞杆菌＞枯草芽孢杆菌＞A.flavithermus＞短小芽孢杆菌＞地衣芽孢杆菌。

（e）FOS+保加利亚乳杆菌抑菌效果如表6所示。

表6 添加FOS+保加利亚乳杆菌对5种耐热菌抑菌效果

由表6中可以看出，FOS+保加利亚乳杆菌混合添加对5种耐热菌抑制效果从强到弱分别为短小芽孢杆菌＞蜡样芽胞杆菌＞地衣芽孢杆菌＞枯草芽孢杆菌＞A.flavithermus。

（f）FOS+嗜酸乳杆菌抑菌效果如表7所示。

表7 添加FOS+嗜酸乳杆菌对5种耐热菌抑菌效果

由表7中可以看出，FOS+嗜酸乳杆菌混合添加对5种耐热菌抑制效果从强到弱分别为短小芽孢杆菌＞枯草芽孢杆菌＞A.flavithermus＞地衣芽孢杆菌＞蜡样芽胞杆菌。

（g）FOS+保加利亚乳杆菌+嗜酸乳杆菌抑菌效果如表8所示。

表8 添加FOS+保加利亚乳杆菌+嗜酸乳杆菌对5种耐热菌抑菌效果

由表8中可以看出，FOS+保加利亚乳杆菌+嗜酸乳杆菌混合添加对5种菌抑制效果从强到弱分别为短小芽孢杆菌＞蜡样芽胞杆菌＞地衣芽孢杆菌＞A.flavithermus＞枯草芽孢杆菌。

添加的抑菌物质对5种耐热菌具有一定的抑菌效果，且添加方式不同对5种耐热菌抑制效果各有不同。

2.2.3 以抑菌物质对单独菌株抑菌效果评价

（a）抑制短小芽孢杆菌生长效果如表9所示。

表9 添加不同抑菌物质对短小芽孢杆菌抑菌效果

由表9中可以看出，对短小芽孢杆菌抑菌效果而言，单独添加保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌以及FOS效果相比差异显著（P＜0.05），且添加FOS在3种单独添加物质相比效果最好；单独添加FOS与添加FOS+保加利亚乳杆菌效果相比差异显著（P＜0.05），但与添加FOS+嗜酸乳杆菌相比差异不显著（P＞0.05），因此在添加FOS基础上再添加保加利亚乳杆菌作为抑菌物质具有明显的促进抑制短小芽孢杆菌生长效果。

（b）抑制枯草芽孢杆菌生长效果如表10所示。

表10 添加不同抑菌物质对枯草芽孢杆菌抑菌效果

由表10可以看出，对枯草芽孢杆菌抑菌效果而言，单独添加保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌以及FOS抑菌效果差异显著（P＜0.05）。FOS、FOS+嗜酸乳杆菌及FOS+保加利亚乳杆菌添加方式抑菌效果差异极显著（P＜0.01），但是FOS+保加利亚乳杆菌与FOS+保加利亚乳杆菌+嗜酸乳杆菌添加方式差异极不显著（P＞0.01），因此在FOS+保加利亚乳杆菌基础上添加嗜酸乳杆菌抑菌效果不明显。保加利亚乳杆菌+嗜酸乳杆菌、FOS+保加利亚乳杆菌以及FOS+保加利亚乳杆菌+嗜酸乳杆菌添加方式抑菌效果差异不显著（P＞0.05），因此保加利亚乳杆菌+嗜酸乳杆菌、FOS+保加利亚乳杆菌两种添加方法能较好的满足抑制枯草芽孢杆菌生长。

（c）抑制地衣芽孢杆菌生长效果如表11所示。

由表11可以看出，对枯草芽孢杆菌抑菌效果而言，单独添加保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、FOS以及保加利亚乳杆菌+嗜酸乳杆菌混合添加的抑菌效果差异不显著（P＞0.05）；且添加FOS+保加利亚乳杆菌与添加FOS+保加利亚乳杆菌+嗜酸乳杆菌效果相比差异不显著（P＞0.05），但是添加FOS抑菌效果与该两组相比都差异显著（P＜0.05），可以看出在添加FOS基础上再添加保加利亚乳杆菌作为抑菌物质具有明显的促进抑制地衣芽孢杆菌生长效果。该实验结果与短小芽孢杆菌抑菌效果类似。

（d）抑制蜡样芽孢杆菌生长效果如表12所示。

表11 添加不同抑菌物质对地衣芽孢杆菌抑菌效果

表12 添加不同抑菌物质对蜡样芽孢杆菌抑菌效果

由表12可以看出，对蜡样芽孢杆菌抑菌效果而言，FOS在三种单独添加物质里面抑菌效果相比差异显著（P＜0.05），且较差。对于FOS、FOS+保加利亚乳杆菌与FOS+保加利亚乳杆菌+嗜酸乳杆菌抑菌效果差异显著（P＜0.05），因此对于蜡样芽胞杆菌而言，三种物质同时添加抑菌效果最佳。

（e）抑制A.flavithermus生长效果如表13所示。

表13 添加不同抑菌物质对A.flavithermus抑菌效果

由表13可以看出，对A.flavithermus抑菌效果而言，FOS+保加利亚乳杆菌+嗜酸乳杆菌与其他组抑菌效果相比差异极限著（P＜0.01），因此对于A.flavithermus而言，同时添加三种抑菌物质效果较佳。这与抑制蜡样芽胞杆菌生长添加抑菌物质方式类似。

3 讨论

3.1 菌种分离鉴定

耐热菌的危害很早就受到人们的重视，在乳制品生产中不同的温湿度条件、乳制品不同的生产工艺和乳制品生产中不同来源的原料都会影响到产品中耐热菌的种类和数量。从分离的菌株种类来看，地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌等一些耐热芽孢菌为生产中占比例较大的污染菌［12］。因此可针对这类芽孢菌在生产中进行专门的工艺控制处理，如二次加热方法［13］等降低该类芽孢菌的数量，最终减少产品污染，提高产品品质；同时研究对乳制品生产过程中影响较大的生物膜来减少耐热菌对整个生产流程污染。从菌株分离来源上看，原料中耐热菌微生物种类较多，是重要的耐热菌污染源头之一，建议在实际生产中严格执行原料验收标准，降低生产中由原料造成的微生物污染［14］。

3.2 抑菌实验

添加的FOS、保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌对分离鉴定出来的5种耐热菌具有抑菌效果，抑菌物质组合添加抑菌效果较好。根据每种耐热菌对抑菌物质添加方式敏感程度不同，较优的抑菌物质添加方式如下：（1）对抑制短小芽孢杆菌生长而言，添加FOS基础上再添加保加利亚乳杆菌作为抑菌物质具有明显的促进抑制短小芽孢杆菌生长效果；（2）保加利亚乳杆菌+嗜酸乳杆菌、FOS+保加利亚乳杆菌两种添加方法都能较好的满足抑制枯草芽孢杆菌生长效果；（3）在添加FOS基础上再添加保加利亚乳杆菌具有明显的促进抑制地衣芽孢杆菌生长效果；（4）FOS+保加利亚乳杆菌+嗜酸乳杆菌组合添加对抑制蜡样芽孢杆菌生长效果较佳；（5）FOS+保加利亚乳杆菌+嗜酸乳杆菌组合添加对抑制蜡样芽孢杆菌生长效果较佳。

4 结论

（1）分离的菌株种类来看，地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌等一些耐热芽孢菌为奶制品生产中优势菌；原料为耐热菌重要污染来源之一。

（2）抑菌物质对耐热菌有一定的抑制效果，抑菌物质组合添加抑菌效果更佳；对于不同的耐热菌，有针对性选择抑菌物质能起到较好的抑菌效果。

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Isolation and identification of thermoduric bacteria in the production of dairy products and evaluate antimicrobial effect

WANG Lin-lin1，HE Guang-hua1，CHU Xiao-jun1，LI Hai-long1，HAO Dong-hai1，LIN Xue-hai2，LIU Fu-sheng1
（1.Beingmate Baby&Child Food Co.，Ltd，Hangzhou，311106，China 2.School of Biological and Chemical Engineering，Zhejiang provincial Key Lab for Chem&Bio Processing Technology of Farm produces，Zhejiang University of Science and Technology，Hangzhou 310023，China；）

Thermoduric bacteria from pollution sites which convenient contaminated by microorganism are isolated and identified during dairy production；as antibacterial substances，oligofructose、Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus bulgaricus are applied to evaluated bacteriostatic effect on thermoduric bacteria.Results show that thermoduric bacillus such as Bacillus licheniformis，Bacillus subtilis，Bacillus cereus are dominant bacteria on dairy production；raw material is one of the main pollution of thermoduric bacteria.The antibacterial material has certain inhibitory effect on the growth of thermoduric bacteria，and the bacteriostatic effect with combination of antibacterial is much better；desirable antibacterial effect on different thermoduric bacteria can be achieved via the addition of antibacterial substances in different ways.

dairy products；thermoduric bacteria；bacteriostatic effect；bacillus

Q93-331

A

1001-2230（2016）08-0012-05

2016-04-25

杭州市科技项目（20140533B74）。

王林林（1988-），男，助理研发工程师，从事乳品微生物控制方面研究。

何光华