PKHD1突变致儿童门脉高压4例病例报告

颜艳燕 龚敬宇 施莺燕 陆 怡 张梅红 谢新宝 王建设 林 锦

·论著·

PKHD1突变致儿童门脉高压4例病例报告

颜艳燕1,2龚敬宇2施莺燕3陆 怡4张梅红2谢新宝4王建设4林 锦1

目的 通过二代测序探讨儿童不明原因门脉高压的遗传病因，以提高临床认识。方法 2012至2016年3月在复旦大学附属金山医院收治的4例不明原因的儿童门脉高压病例，均进行全外显子测序或肝病基因Panel的高通量测序，对临床表现进行回顾性分析。结果 4例患儿中，男1例，女3例，发病年龄3.3～6.4岁。主要临床表现为上消化道出血3例，脾肿大4例，肝肿大2例；肝内胆管扩张1例；转氨酶轻度升高2例。4例患儿影像学上均有肾脏病变，肝脏合成功能和肾功能均正常。二代基因测序及Sanger验证，4例患儿均在PKHD1基因上发现复合杂合突变，其中无义突变和经典剪切位点突变各1个，缺失突变(移码突变)和错义突变(少见位点)各3个。例1外显子32 上第4 481位碱基A缺损造成移码突变和外显子51的前1位内含子区碱基G突变为A影响剪切位点；例2外显子24上第2 507位碱基T突变为C，导致第836位上的缬氨酸变为丙氨酸，外显子58上第9 568位碱基C突变为T，导致编码第3 190位谷氨酰胺的密码子变成终止密码子。例3外显子12上第847位碱基T突变为C，导致第283位上的苯丙氨酸转变为亮氨酸，外显子58上第9 455位密码子A缺失导致移码突变。例4外显子61上第10 315位碱基G突变为T，导致第3 429位上的天冬氨酸转变为酪氨酸，外显子27上第3 028至3 039位碱基缺失，并插入AGGT导致移码突变。最终4例患儿均确诊为常染色体隐性遗传性多囊肾病。结论PKHD1基因突变引起的常染色体隐性遗传性多囊肾病是我国儿童门脉高压的重要病因，二代基因测序是确诊的有效手段。

门脉高压； 多囊肾； 常染色体隐性遗传； 基因； 儿童

1 病例资料

2012 年至2016年3月在复旦大学附属金山医院收治4例不明原因的儿童门脉高压病例。表1显示，男1例，女3例，发病年龄3.3～6.4(4.7)岁。生后均无窒息抢救史，生长发育无特殊记载，否认毒物接触史。例4患儿父亲为乙肝病毒携带者，余父母均体健，否认近亲结婚及家族遗传病史。患儿就诊因上消化道出血2例，脾肿大1例，上消化道出血伴肝脾肿大1例。肝脏肿大2例，均为剑突下可达5 cm，4例脾脏肿大，左侧肋缘下4～13 cm。移动性浊音阳性1例，腹壁静脉显露明显1例。 4例心肺及神经系统查体均未见异常。

实验室检查：2例患儿病程中有1次ALT轻度升高史，3例偶有血胆汁酸升高，余肝功能指标均未见异常。血常规RBC(2.49～4.52)×1012·L-1；Hb 62.2～118 g·L-1；WBC(1.7～7.89)×109·L-1； PLT(36～245)×109·L-1。4例肾功能指标(尿常规、尿素、肌酐和尿酸)均未见异常。2例病程中凝血酶原时间稍延长，1例活化部分凝血酶原时间稍升高。4例乙肝两对半、丙肝、梅毒、HIV抗体、EB病毒及CMV抗体、铜蓝蛋白、自身抗体等均未见异常。例1曾行骨髓穿刺术排除了骨髓疾病。

影像学检查：例2～4行胃镜检查显示食管胃底静脉曲张，4例腹部CT及增强以及例1、3和4的磁共振胰胆管成像(MRCP)增强均可见食管胃底静脉曲张征象(图1A、B)。例3腹部B超显示肝剑突下5 cm,但MRCP显示肝脏肝裂增宽，体积略缩小；余3例MRCP均显示肝脏肿大。例2和例3腹部B超发现肝脏左右叶比例失调，其中例2腹部CT和MRCP显示肝脏右叶萎缩、左叶及尾状叶增大伴肝内胆管扩张明显(图1C、D、E、F)。例3腹部B超曾显示门静脉主干部分海绵样变性。B超显示，4例均可见脾肿大、均可见双侧肾脏回声增强， 3例伴肾脏强回声光点；MRI显示，例1、3和4双侧肾脏肿大，4例均发现肾脏有囊性信号改变。

表1 4例门脉高压患儿的临床表现、实验室检查结果

注 ALT：丙氨酸氨基转移酶(参考值：7～40 U·L-1)；TBA：总胆汁酸(参考值：0～10 μmol·L-1)；PT：凝血酶原时间(参考值:12～14.8 s)；APTT：活化部分凝血酶原时间(参考值:28～44.5 s)

图1 影像学图像

2 基因检测及结果

经患儿父母知情同意后，留取患儿及其父母外周血1～1.5 mL(EDTA抗凝)，提取DNA，行二代基因测序。例1行人类全基因外显子组测序(测序由上海天昊生物科技有限公司完成)，例2～4行包含代谢性肝病相关的多基因panel测序(测序由北京迈基诺基因科技有限责任公司和北京易德东方转化医学研究中心完成)。测序结果经生物信息学分析后筛选出可疑致病突变，并对分析所得突变进行患儿及其父母的Sanger测序验证。PKHD1基因与GenBank序列(NM_138694 )进行比较。

搜索千人基因组数据库(URL: http://www.1000genomes.org/)了解错义突变位点在人群的频率。错义突变通过Mutation Taster[1]软件进行致病性预测，通过Polyphen-2[2]和SIFT[3](http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/，http://sift.jcvi.org/)软件进行氨基酸替换的致病性预测。在http://www.uniprot.org/uniprot/网页上查询PKHD1编码的fibrocystin蛋白质序列每一段氨基酸的功能，并利用NCBI数据库对人类和其他种属的氨基酸序列进行同源性比较。

表2 4例PKHD1基因检测结果

注 1)核苷酸序列比对的参考序列是NM_138694 ；2)突变已在Liu等[9]的文献中报道

4例均在PKHD1基因上发现复合杂合突变(表2)，无义突变和经典剪切位点突变各1个，缺失突变和错义突变各3个；3个缺失突变均是移码突变，3个错义突变均是少见位点，其致病性预测见表3。Mutation Taster显示3个缺失突变和1个无义突变均会发生NMD(nonsense-mediated mRNA decay)作用。例1发现外显子32 上第4 481位碱基A缺损造成移码突变，外显子51的前1位内含子区碱基G突变为A影响剪切位点，两种突变致病性明确。例2发现外显子24上第2 507位碱基T突变为C，导致第836位上的缬氨酸变为丙氨酸；外显子58上第9 568位碱基C突变为T，导致编码第3 190位谷氨酰胺的密码子变成终止密码子；其中无义突变致病性明确，而错义突变经Polyphen-2 和SIFT均预测氨基酸改变为致病突变。

表3 PKHD1基因错义变异功能预测

注 MAF：千人基因组计划数据库的最小等位基因频率；Mutation TasterP值范围为0～1，P值大小与致病性成正比；Polyphen-2分值范围为0～1，分值大小与致病性成正比；SIFT分值范围为0～1，分值大小与致病性成反比

图2 不同物种纤囊素在283、836、3439位置上的氨基酸序列比对图

例3发现外显子12上第847位碱基T突变为C，导致第283位上的苯丙氨酸转变为亮氨酸；外显子58上第9 455位密码子A缺失导致移码突变；其中移码突变致病性明确，而错义突变在Mutation Taster和Polyphen-2均预测为致病突变。例4发现外显子61上第10 315位碱基G突变为T，导致第3 429位上的天冬氨酸转变为酪氨酸；外显子27上第3 028至3 039位碱基缺失并插入AGGT，导致移码突变；其中移码突变致病性明确，而错义突变在3个预测软件上均预测为致病突变。在蛋白保守性上，3个错义突变所累及的氨基酸均是高保守的氨基酸(图2)。

2 讨论

门脉高压症是由门脉系统血流受阻和(或)血流量增加导致门脉系统内压力升高，并在超过10 mm Hg[4]后所引发的一系列血流动力学改变的临床综合征。门脉高压的病因多样，根据血流受阻部位可分为肝前性、肝性和肝后性。肝前性病因包括肝外门静脉阻塞(门静脉血栓形成)和脾静脉血栓形成等。肝后性病因包括缩窄性心包炎和限制性心肌病等。而肝性病因可再分为窦前性、窦性和窦后性，包括先天性肝纤维化、特发性门脉高压症、维生素A过多症和肝小静脉阻塞等[5]。因门脉高压病因广泛，故门脉高压的病因诊断十分困难。与成人相比，遗传代谢病是儿童门脉高压的重要病因。

本文报道的4例儿童期起病的门脉高压患儿均以脾肿大或/和上消化道出血为就诊原因，经过二代测序，均在PKHD1基因上发现复合杂合突变。经过详细的影像学检查，均伴有肾脏影像学异常改变，且患儿父母均否认肾脏囊肿病史[6,7]，故患儿可确诊为PKHD1基因突变引起的常染色体隐性遗传性多囊肾病(ARPKD)，PKHD1基因突变引起的ARPKD是我国儿童门脉高压的重要原因。

ARPKD的发病率为1∶20 000，人群致病基因的携带率为1/70[8]。其致病基因是位于6号染色体上的PKHD1基因，包含至少86个外显子，最长的开放阅读框由66个外显子组成，编码具有4 074个氨基酸的单次跨膜蛋白纤囊素(FPC)。FPC在胆管和肾小管上皮细胞的初级纤毛上高度表达，但其导致肝纤维化的机制仍不明。迄今为止，AachenPKHD1 database (URL: http://www.humgen.rwth-aachen.de)中有748种基因突变，并且均不包括本文报道的8个突变位点。本文报道的突变中，c.9568C>T是无义突变，导致提前生成终止密码。3个缺失突变均是框移突变，与无义突变一样，将产生可被识别的异常mRNA,发生NMD作用，是致病性明确的病变。c.8108-1G>A是经典的剪切位点突变，将改变mRNA形成过程中的剪切方式，影响蛋白质结构。3个错义突变中所累及的均是高度保守氨基酸，其中c.2507T>C是国内已报道的突变位点[9]，c.847T> C突变所影响的氨基酸所在结构是具有蛋白活性的功能域，c.10315G>T突变导致的氨基酸改变虽然不在已知的蛋白活性功能域，但经软件预测均是致病突变。

因为PKHD1基因外显子多，Sanger测序工作量巨大，因此国内ARPKD的一代基因测序诊断较少见。随着分子诊断技术的不断进步，二代基因测序的费用不断降低，在遗传咨询的需求下，具有高通量优势的二代基因测序成为诊断和鉴别ARPKD 与其他肝肾囊性纤维化病的有力手段。本文3例(例2～4)为1个杂合突变合并1个严重的缺失或无义突变，这与基因型与临床型相关性的分析中认为多数能渡过新生儿期的患儿至少有1个错义突变一致[10]。例1检测到传统意义上的2个严重突变：缺失和剪切位点突变，但患儿临床表现为较轻的儿童期ARPKD，与通常认为的合并有两个严重致病突变会导致严重的表型而致围生期死亡的观点不同[11,12]。因此在遗传咨询上，仍需警惕少数患儿尽管合并有2个严重突变，但在临床上可表现为较轻的临床表现。

ARPKD患儿的肝、肾受累程度差异大，儿童期起病多以肝脏受累为主，本文4例临床上无肾功能受损表现，而仅有肾脏影像学异常。ARPKD患儿肝脏的临床表现，文献报道渡过新生儿期的ARPKD患儿中40%～50%有门脉高压的表现；60%在5岁内出现脾大；21%～52%出现肝脾肿大的体征；5%～37%出现食管静脉曲张，16%～26%合并Caroli病[13-17]。ARPKD患儿几乎均有不同程度的肝脏受累，因胆管板发育障碍表现为先天性肝纤维化、Caroli病以及同时合并前两者的Caroli综合征，并且这3种表现被认为是疾病进展过程中的不同严重程度的不同表现[18]。本文例2患儿在影像学上可见明显的肝内胆管囊状扩张，但是未行肝穿刺检查，无法判断是否合并先天性肝纤维化。根据患儿门脉高压的临床表现显著推测患儿为ARPKD合并Caroli综合征的可能性大。因此，临床上对于表现为不明原因脾大、门脉高压或肝内胆管扩张的儿童，需高度警惕该病，必要时行肝穿刺检查。如果患儿肝脏病理上表现为特征性的先天性肝纤维化[19]，应予患儿肾功能及肾脏的影像学检查以协助诊断，并行基因检测以明确疾病。

综上所述，对于临床表现为门脉高压、脾肿大或肝内胆管扩张的患者，需警惕PKHD1基因突变引起的ARPKD，需要仔细进行肾功能和肾脏影像检查，并进行包括PKHD1基因在内的二代基因测序。

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(本文编辑：张崇凡)

PortalhypertensioncausedbyPKHD1mutationsinchildren: 4casesreport

YANYan-yan1,2,GONGJing-yu2,SHIYing-yan3,LUYi4,ZHANGMei-hong2,XIEXin-bao4,WANGJian-she4,LINJin1

(1DepartmentofNeonatology,SecondAffiliatedHospital,YuyingChildren'sHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027; 2DepartmentofPediatrics,JinshanHospitalofFudanUniversity,Shanghai201508; 3DepartmentofRadiology,Children'sHospitalofFudanUniversity,Shanghai201102; 4DepartmentofInfectiousDisease,Children'sLiverCenter,Children'sHospitalofFudanUniversity,Shanghai201102,China)

Corresponding Author：WANG Jian-she, E-mail: jshwang@shmu.edu.cn ; LIN-Jin, E-mail: Jing.Lin@mssm.edu

ObjectiveUsing the next generation sequencing to explore the etiology of Chinese children with portal hypertension, which was hard to be diagnosed by routine examinations.MethodsThe whole exome sequencing and hepatic panel were used to explore the cause of four children with portal hypertension hospitalized in Jinshan Hospital of Fudan University from 2012 to March 2016. The clinical features were summarized retrospectively.ResultsThe patients consisted of one male and three females, and their ages of onset ranged from 3.3 to 6.4 years with average age of 4.65 years. The main clinical features included upper gastrointestinal hemorrhage in three patients, splenomegaly in four patients, hepatomegaly in two patients, intra-hepatic bile duct dilation in one patient, elevation of serum alanine aminotransferase in two patients. Kidney lesions were detected by imaging in all patients, whereas both hepatic synthetic function and kidney function were tested to be normal. Finally, diverse compound heterozygous mutations were identified inPKHD1 gene in all patients by the next generation sequencing and confirmed by Sanger sequencing. The identifiedPKHD1 gene mutations included one nonsense mutation, one typical splicing site mutation, three deletion mutation induced frameshift mutations, and three rare missense mutations. c.8108-1G>A and c.4481delA p.N1494fs were identified in case 1, c.9568C>T p.Q3190X and c.2507T>C p.V836A were identified in case 2, c.9455delA p.N3152fs and c.847T>C p.F283L were identified in case 3, c.10315G>T p.D3439Y and c.3028-c.3039delGGAGAAGACCTCinsAGGT p.G1010fs were identified in case 4. All four children were diagnosed with autosomal recessive polycystic kidney disease. ConclusionAutosomal recessive polycystic kidney disease is an important cause of noncirrhotic portal hypertension in children, and the next generation sequencing is an effective method for diagnosis.

Portal hypertension; Polycystic kidney; Autosomal recessive; Gene; Children

新一轮上海市医学重点专科建设计划项目(A类)：ZK2015A04；国家自然科学基金项目：81570468

1 温州医科大学附属第二医院育英儿童医院新生儿科 温州， 325027；2 复旦大学附属金山医院儿科 上海，201508；3 复旦大学附属儿科医院放射科 上海，201102；4 复旦大学附属儿科医院感染传染科，儿童肝病中心 上海，201102

王建设， E-mail: jshwang@shmu.edu.cn；林锦，E-mail:jing.lin@mssm.edu

10.3969/j.issn.1673-5501.2016.06.011

2016-08-19

2016-10-18)