一种初步快速甄别总肠道病毒的基因分型方法

欧志英　吴韶清　尹应先　李丽霞　周荣　徐翼　龚四堂



一种初步快速甄别总肠道病毒的基因分型方法

欧志英★吴韶清尹应先李丽霞周荣徐翼龚四堂

［摘要］目的建立并验证总肠道病毒5′⁃非编码区（5′⁃non coding region,5′⁃NCR）PCR扩增测序并在NCBI数据库比对进行生物信息分析的方法，为手足口病的早期快速诊断提供敏感、高效的总肠道病毒分子分型检测方法。方法收集165例临床检测阳性的标本，提取总RNA扩增人肠道病毒A、B、C和D型5′端非编码区用于总肠道病毒初步基因分型，PCR产物测序并在Genbank中进行BLAST分析。结果成功从临床咽拭子标本中扩增了5′⁃NCR用于基因分型。165例总肠道病毒阳性标本中鉴定出12种肠道病毒类型，有77例人肠道病毒（enterovirus type 71，EV⁃71），37例人柯萨奇病毒（coxsackievirus，CV）CV⁃A16，31例CV⁃A4，20例其它型别。结论5′⁃NCR PCR测序是总肠道病毒基因分型和监测的敏感、简单、早期、快速的检测方法。

［关键词］手足口病；肠道病毒；分子流行病学；分子分型

手足口病是常见的儿童急性感染性疾病，主要由肠道病毒（enterovirus,EV）感染引起［1］，过去几十年在亚太地区很常见，曾在马来西亚、台湾、新加坡、中国大陆爆发流行［2⁃3］，导致成千上万儿童死亡，大多数患者症状较轻，为一过性自限疾病，少数症状严重。感染后大部份患者会出现发烧，体温超过38.5℃［4］，并伴有手、足、口腔部位皮疹、疱疹、溃疡为典型表现［5］，个别重度感染可引起肺水肿、病毒性脑膜炎或脑膜脑炎、疱疹性咽峡炎、病毒性心肌炎甚至死亡［6］。

肠道病毒在分类上属微小核糖核酸（RNA）病毒科，人肠道病毒由至少72个血清型组成，种类有人脊髓灰质炎病毒、人柯萨奇病毒（coxsacki⁃evirus，CV）A组、B组、埃可病毒（Echo）和新型肠道病毒。人柯萨奇病毒A组有1~22型和24型，B组有1~6型，新型肠道病毒有68~72型［7-8］。大多数手足口病是人柯萨奇病毒和新型肠道病毒感染引起［5］，人柯萨奇病毒A16型和EV⁃71是最常见类型。

近些年手足口病发病有上升趋势，呈普遍性、爆发性流行，危害儿童健康发展。临床上手足口病感染无特异、高效的疫苗和治疗药物，只能对症支持治疗，积极防止发生并发症。早确诊、早治疗是该病愈后的关键。目前手足口病实验室检测的方法有病毒分离培养、血清学实验、核酸分子检测，确诊的金标准仍然是病毒分离培养。病毒分离培养和血清学实验耗时较长，核酸分子检测一般针对EV⁃71和/或CV⁃A16进行检测，不利于疾病诊断、监测和治疗，亟待开发简单、高效、快速诊断的对总肠道病毒进行检测和分型的试剂。本研究的目的是建立并验证总肠道病毒5′⁃非编码区（5′⁃non coding region，5′⁃NCR）PCR扩增测序并在NCBI数据库进行生物信息比对分析的方法，为手足口病的早期快速病原诊断提供敏感、高效的总肠道病毒分子分型检测方法。

1　材料与方法

1.1临床标本及RNA提取

2008年5月至7月在广州市妇女儿童医疗中心收集165例临床检测阳性的手足口病门诊患者的咽拭子标本。取200 μL咽拭子浸出液，用RNA提取试剂盒QIAamp Viral RNA Mini kit（Qiagen，美国）提取总RNA，最后溶解在无菌、无RNA酶的DEPC水中。

1.2引物设计

通过生物信息比对分析，在NCBI数据库中找出所有肠道病毒核酸序列，在其保守区，即5′⁃NCR设计了一对简并引物：上游引物PEF：5′⁃AYCYTT⁃GTRCGCCTGTTTT⁃3′，下游引物PER：5′⁃CCCA AAGTGTCGGTTCCGC⁃3′（图1）。血清型包括CV⁃A1~A24型、B1~B6型，EV⁃71的Taiwan、Shenzhen、Korea、Singapore病毒株，埃可病毒2~7、9、11~17、19~22、24~26和29~33型。

1.3RT⁃PCR

50 μL一步法RT⁃PCR扩增体系包含：1×一步法RNAPCR缓冲液、上下游引物浓度分别为0.3μM、1.5 mM MgCl2、200 μM dNTP、40 U Rnase抑制剂、5 U AMV逆转录酶XL、5 U AMV Taq DNA聚合酶、8 μL RNA模板。逆转录条件为：94℃预变性2 min，50℃30 min；PCR扩增条件94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸45 s；共35个循环；最后72℃延伸7 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳、0.5 mg/mL EB染色。

1.4PCR产物纯化和测序分析

PCR产物胶分离后用割胶纯化试剂盒QIA⁃quick Gel Extraction kit（Qiagen，美国）纯化。测序试剂盒为ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Se⁃quencing Ready Kit（Applied Biosystems Inc.，美国），测序仪为Genetic Analyzer 377（Applied Bio⁃systems Inc.，美国）。

1.5序列解读

每个临床标本5′⁃NCR PCR⁃测序所得序列都与NCBIGenBank（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi）中的各型人肠道病毒血清型序列两两比对，根据查询覆盖得分和同一性得分得出各标本的血清型。本研究中501 bp的5′⁃NCR序列一致性得分大于91%时被视为同一肠道病毒血清型。

1.6敏感性和特异性

EV⁃71病毒标准株纯化培养用于检测本方法的灵敏性，病毒滴度分别稀释为1×106、1×105、1× 104、1×103、1×102、1×101和1×100拷贝数/μL，RNA分别提取并用一步法扩增。同时用EV⁃71和CV⁃A16的阳性标本、非肠道病毒标本流感A、流感B、呼吸道合胞病毒、疱疹病毒检测了本方法的特异性。

1.7统计学分析

数据的统计评价用SPSS 19.0统计分析软件，P<0.05被视为有显著差异。

2　结果

2.1一步法RNA PCR

简并引物成功地扩增了临床标本，具有特异、有效的特点，扩增片段长度为501 bp，符合我们的设计（图2）。

2.2手足口病患者血清型分布

本研究165例肠道病毒感染阳性，其中77例EV⁃71（46.67%）、31例CV⁃A4（18.79%）、37例CV⁃A16（22.42%）、20例（12.12%）其他肠道病毒血清型，序列同源性基本达到97%以上（表1）。5′⁃NCR PCR产物测序成功，获得12种肠道病毒血清型。

2.3敏感性和特异性

用EV⁃71病毒检测本方法灵敏性，结果表明本方法能成功扩增1×108拷贝数/μL、1×107拷贝数/ μL、1×106拷贝数/μL、1×105拷贝数/μL、1×104拷贝数/μL、1×103拷贝数/μL，PCR条带的亮度随病毒滴度下降而变弱（图3），本方法能有效扩增EV⁃71和CV⁃A16，其他病原体流感A、流感B、腺病毒、呼吸道合胞病毒、疱疹病毒未扩增出任何条带（图4）。

3　讨论

手足口病是一类伴发热的疾病（体温大于37.5℃），是相对温和的自限性疾病，过去几十年频繁爆发，而且呈现出上升趋势，也有重症死亡的病例，成为亚太地区重要的公共卫生问题，手足口病重症致死与肠道病毒血清型有关，主要是肠道病毒A型感染引起。CV⁃A16、EV⁃71、Echo和CV⁃B组是最常见的病因［9-11］。CV⁃A16最早于1957年在加拿大分离获得［12］，1968至1974年日本爆发手足口病主要是CV⁃A16引起［13］。20世纪70年代以后EV⁃71成了手足口病的主要病因［14］。本文提供了总肠道病毒同时检测的方法，2008年5月至7月在我们医院就诊患者中手足口病爆发时检出EV⁃71和CV⁃A16为主（表1），EV⁃71感染可引起病毒性脑炎或脑膜脑炎，CV⁃A16感染可引起病毒性心肌炎，因此结合临床症状，早期病原监测为患者争取更多的时间用于临床治疗意义重大。

肠道病毒鉴定的金标准是病毒分离和培养，随后用中和实验确定血清型。这一传统的诊断方法有其缺点：（1）耗时、费力，时间长；（2）64种血清型抗体库中只有40种抗体，有时存在交叉反应；（3）全球范围30年前制备的抗血清有限；（4）毒株或抗原变异导致抗体凝集［15-16］；（5）有些肠道病毒在细胞中复制能力较差难以分型；（6）当需要更深入地了解更多详细的病毒特征时，需要同时接种多种细胞株进行病毒分离培养，找出敏感的细胞株，耗时费力，工作量非常大［17］。

肠道病毒分子流行病学分析通常是以衣壳蛋白VP1为基础分析，VP1具有型特异性［15-16，18］，在疾病爆发早期能绕过病毒分离培养，有助于集中有限的资源，快速鉴定病例之间的流行病学关联分析。VP1基因分析方法只针对一种血清型设计，一次分析无法针对所有的肠道病毒血清型，而且扩增效率不高，扩增片段短，简并引物不适合直接PCR产物测序、VP1基因序列存在复杂变异等缺点限制了VP1在总肠道病毒分析中的应用，总肠道病毒基因分型需要多对引物和多个反应才能完成，目前没有快速有效的针对总肠道病毒进行基因分型的方法。在疾病爆发时总肠道病毒分析变得复杂，单个的VP1基因分析不足以监测和甄别不同类型的总肠道病毒。研究表明5′⁃NCR的系统发生与肠道病毒血清型无直接关系［19］。但我们通过对所有肠道病毒序列比对分析表明，5′⁃NCR存在高度同源性，但各血清型之间也存在差异性，于是在总肠道病毒的保守区设计引物扩增，确保单管单反应能扩增出所有肠道病毒血清型，我们的结果表明该方法能特异地扩增总肠道病毒，以不同病毒滴度的EV⁃71验证本方法的灵敏度，1×103拷贝数/μL的标本能成功扩增，方法学上达到了目前PCR方法的灵敏度标准。

表1　手足口病病例和肠道病毒血清型分布Table 1　Distribution of HFMD case and enterovirus serotypes

肠道病毒血清型鉴定对临床患者管理有一定的意义，分子分型还可以在疾病监测方面提供有价值的流行病学信息。通过我们建立的PCR⁃测序方法从临床样本中鉴定了CV A型、CV B型、EV⁃71的不同分离株和埃可病毒。从研究结果可知有12种肠道病毒与2008年手足口病爆发有关，其中EV⁃71 和CV占的比例最大，可能是引起此次爆发的主要病原。

我们所建立的方法优点在于，首先是基于单管单反应，其次是一步法RT⁃PCR扩增测序获得了501 bp的扩增片段，含746核苷酸的5′⁃NCR是肠道病毒基因组的重要区域，负责起始RNA合成、病毒蛋白表达调节，是一个相对稳定的区域，对病毒宿主反应和致病性至关重要，具有91%以上同源性的序列分析表明501 bp扩增片段可以保证血清分型的准确性和特异性。获取临床标本后，1 h内完成RNA提取，RT⁃PCR扩增2 h内完成，测序也在3 h内完成，所以一旦有手足口病疫情，不管是哪一种肠道病毒引起，一天之内就可以出具分析报告，指导临床治疗和卫生决策。综上所述，本方法具有快速、方便、准确、高效的特点。

参考文献

［1］Ooi MH，Wong SC，Mohan A，et al.Identification and validation of clinical predictors for the risk of neu⁃rological involvement in children with hand，foot，and mouth disease in Sarawak［J］.BMC Infect Dis，2009，9：3.

［2］Yap MS，Tang YQ，Yeo Y，et al.Pluripotent human embryonic stem cell derived neural lineages for in vitro modelling of enterovirus 71 infection and therapy［J］. Virol J，2016，13：5.

［3］Xing W，Liao Q，Viboud C，et al.Hand，foot，and mouth disease in China，2008⁃12：an epidemiological study［J］.Lancet Infect Dis，2014，14（4）：308⁃318.

［4］Lee DS，Lee YI，Ahn JB，et al.Massive pulmonary hemorrhage in enterovirus 71⁃infected hand，foot，and mouth disease［J］.Korean J Pediatr，2015，58（3）：112⁃115.

［5］Grist NR，Bell EJ，Assaad F.Enteroviruses in human disease［J］.Progress in Medical Virology.Fortschritte Der Medizinischen Virusforschung.Progres En Virolo⁃gie Medicale，1978，24：114-157.

［6］Tao Z，Wang H，Li Y，et al.Molecular epidemiology of human enterovirus associated with aseptic meningi⁃tis in Shandong province，China，2006-2012［J］. Plos one，2014，9（2）：e89766.

［7］Fauquet CM，Mayo MA，Maniloff J，et al.Virus tax⁃onomy：eighth report of the international committee on taxonomy of viruses［M］.San Diego：Elsevier Aca⁃demic Press，2005.

［8］Brown BA，Pallansch MA.Complete nucleotide se⁃quence of enterovirus 71 is distinct from poliovirus［J］. Virus research，1995，39（2-3）：195-205.

［9］Itagaki A，Ishihara J，Mochida K，et al.A clustering outbreak of hand，foot，and mouth disease caused by Coxsackie virus A10［J］.Microbiology and immunolo⁃gy，1983，27（11）：929-935.

［10］Lum LC，Chua KB，mcMinn PC，et al.Echovirus 7 associated encephalomyelitis［J］.Journal of clinical vi⁃rology，2002，23（3）：153-160.

［11］Chan YF，AbuBaker S.Recombinant human enterovi⁃rus 71 in hand，foot and mouth disease patients［J］. Emerging infectious diseases，2004，10（8）：1468-1470.

［12］Drebot MA，Campbell JJ，Lee SH.A genotypic char⁃acterization of enteroviral antigenic variants isolated in eastern Canada［J］.Virus research，1999，59（2）：131-140.

［13］Hosoya M，Kawasaki Y，Sato M，et al.Genetic diver⁃sity of coxsackievirus A16 associated with hand，foot，and mouth disease epidemics in Japan from 1983 to 2003［J］.Journal of clinical microbiology，2007，45 （1）：112-120.

［14］Brown BA，Oberste MS，Alexander JP，et al.Molecu⁃lar epidemiology and evolution of enterovirus 71 strains isolated from 1970 to 1998［J］.Journal of virology，1999，73（12）：9969-9975.

［15］Oberste MS，Maher K，Kilpatrick DR，et al.Typing of human enteroviruses by partial sequencing of VP1 ［J］.Journal of clinical microbiology，1999，37（5）：1288-1293.

［16］Oberste MS，Maher K，Flemister MR，et al.Compari⁃son of classic and molecular approaches for the identifi⁃ cation of untypeable enteroviruses［J］.Journal of clini⁃cal microbiology，2000，38（3）：1170-1174.

［17］Nix WA，Oberste MS，Pallansch MA.Sensitive，seminested PCR amplification of VP1 sequences for di⁃rect identification of all enterovirus serotypes from original clinical specimens［J］.Journal of clinical mi⁃crobiology，2006，44（8）：2698-2704.

［18］Li J，Sun Y，Du Y，et al.Characterization of cox⁃sackievirus A6⁃and enterovirus 71⁃associated hand foot and mouth disease in Beijing，China，from 2013 to 2015［J］.Front Microbiol，2016，7：391.

［19］Siafakas N，Markoulatos P，Stanway G.Molecular classification of coxsackie A viruses on the basis of the 5′⁃UTR：structural and evolutionary aspects［J］.J Mol Evol，2002，55（6）：638-652.

★通讯作者：欧志英，E⁃mail：ou_zhiying@qq.com

基金项目：广东省自然科学基金（S2012010009538,2016A030313501）；广州市妇女儿童医疗中心博士启动基金（2008031）

作者单位：广州市妇女儿童医疗中心，广东，广州510623

A rapid genotyping assay for primary total enterovirus screening

OU Zhiying★,WU Shaoqing,YIN Yingxian,LI Lixia,ZHOU Rong,XU Yi,GONG Sitang
(Guangzhou Women and Children′s Medical Center,Guangzhou,Guangdong,China,510623)

［ABSTRACT］ObjectiveTo establish and verify an anaytical method for total enterovirus genotyping.Through 5’⁃non coding regions PCR amplification,sequencing and Blast in NCBI databases,this method aims to provide a sensitive,efficient and early rapid genotyping detection for hand,foot and mouth disease.MethodsThroat swab samples from 165 cases of HFMD are collected for RNA extraction.Direct total enterovirus genotyping was carried out by amplifying the 5′⁃non coding region of human enterovirus species group A,B,C and D.PCR products were sequenced and blasted in Genbank.ResultsThe 5′⁃non coding region was successfully amplified for total enterovirus genotyping.12 types of enterovirus were successfully identified from 165 positive clinical cases.There are 77 cases of EV⁃71,37 cases of CV⁃A16,31 cases of CV⁃A4,20 cases of other types.ConclusionThe 5′⁃non coding region PCR⁃sequencing is a sensitive,simple, early,and rapid method for HFMD pathogen genotyping and surveillance.

［KEY WORDS］Hand,foot and mouth disease(HFMD);Enterovirus;Molecular epidemiology; Genotyping