酒精对肝脏蛋白酶体成熟的影响

张莉　阎明　　江堤　　孙贤久　左海军　刘美红



酒精对肝脏蛋白酶体成熟的影响

张莉1阎明2★江堤1孙贤久1左海军1刘美红1

[摘要]目的建立大鼠酒精性肝病模型，分析蛋白酶体成熟蛋白（proteasome maturation protein, POMP）的表达量，探讨酒精对肝脏蛋白酶体成熟的影响。方法利用灌胃的方法建立大鼠酒精性肝病模型，分批于6、8、10、12周处死大鼠。采用荧光定量PCR方法测定POMP mRNA表达量。结果荧光定量PCR显示蛋白酶体成熟蛋白POMP基因表达水平随摄酒增多呈逐渐升高趋势（P<0.05）。结论酒精摄入可影响蛋白酶体成熟，酒精导致的蛋白酶体成熟机制异常可能在蛋白酶体功能下降机制中起重要作用。

[关键词]大鼠；酒精性肝病；蛋白酶体；蛋白酶体成熟蛋白；蛋白质氧化损伤

酒精性肝病发病率逐年升高，已成为我国仅次于病毒性肝炎的第二大肝病病因[1]。长期酒精摄入可导致氧化应激，造成蛋白质氧化损伤。蛋白酶体可降解细胞中绝大部分的氧化蛋白，是机体重要的抗氧化保护机制[2]，当其功能受损时可导致氧化蛋白的蓄积，是肝细胞损伤的重要原因[3]。长期酒精摄入所导致的肝细胞损伤是否由于蛋白酶体成熟障碍引起其功能降低致氧化蛋白不能被有效清除尚不清楚，本文通过测定肝脏蛋白酶体成熟蛋白POMP的表达量，探讨酒精对肝脏蛋白酶体成熟的影响。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物

成年健康雄性Wistar大鼠40只（4周龄），体重180~200 g，购自山东大学医学院实验动物中心。

1.1.2试剂

Trizol提取液（Invitrogen，美国），SYBR Pre⁃mix TaqTM（大连宝生物工程有限公司），M⁃MLV逆转录酶（Promega，美国），引物（上海英骏生物技术有限公司）。

1.2方法

1.2.1模型的建立

正常喂养1周后将大鼠随机分为5组：对照组、模型组（共4组），各8只。模型组通过酒精灌胃方法建立动物模型：40%酒精5 g/kg至第4周末，随后50%酒精7 g/kg至第8周末，60%酒精10 g/kg至第12周末，每日量分2次给予。对照组给予相同体积生理盐水。大鼠分别于造模6、8、10、12周时处死[4]。

1.2.2实时荧光定量PCR检测POMP基因含量

按Trizol说明书进行肝组织RNA提取，紫外分光光度法定量后进行逆转录。逆转录反应体系（总RNA 1 μL、M⁃MLV逆转录酶1 μL、逆转录缓冲液7 μL、随机引物2 μL，加去RNase水补至20 μL），扩增参数：37℃逆转录1 h，95℃灭活10 min。PCR反应体系（SYBR荧光染料10 μL，上下游引物各0.6 μL，cDNA 1 μL，双蒸水7.8 μL)。POMP上游引物序列为5′⁃CCCCTGAAGTTA⁃CAGGTGGA⁃3′,下游引物序列为5′⁃AGCGTAG CTCACCCATCAGT⁃3′，扩增产物长度为169 bp；内参β⁃actin上游引物序列为5′⁃CGTTGACATCCG⁃TAAAGACC⁃3′,下游引物序列为5′⁃TAGAGC⁃CACCAATCCACACA⁃3′，扩增产物长度为176 bp。所有引物均采用Primer5.0设计并经过NCBI Blast验证产物特异性。扩增完成后根据Ct值计算相对表达量。

1.3统计学处理

数据处理采用SPSS 18.0统计软件，各组样本均数的比较采用One⁃Way ANOVA方差分析。

2　结果

2.1肝组织病理学表现

灌酒6周时肝细胞排列尚整齐，部分肝细胞内可见少量脂肪变性，肝小叶中央区域明显；8周时肝细胞内脂滴明显增多，细胞核被推挤至细胞一侧；10周时肝细胞排列紊乱，细胞肿胀，胞质疏松，含有大量脂滴；12周时肝小叶结构破坏，肝细胞脂肪变进一步加重，可见明显肿胀及炎细胞浸润（图1）。

2.2血清生物化学指标检测

由表1可见，灌酒6、8、10、12周大鼠血清甘油三酯（triglyceride,TG）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate amino transferase,AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）等指标均高于对照组，并呈逐渐增高趋势，差异有统计学意义。

表1　血清生化指标含量测定 （mmol/L）Table 1　The serum biochemical criterion（mmol/L）

2.3肝组织POMP基因荧光定量PCR熔解曲线分析

由表2结果可知，随摄酒时间延长，模型各组肝组织POMP mRNA相对表达量（0.42±0.40、0.63± 0.44、3.48±2.50、4.22±3.31），模型组大鼠肝组织中POMP基因表达量逐渐升高，模型3组及4组与正常对照组相比有明显差异（P<0.05）。

3　讨论

酒精在肝脏内的氧化代谢可产生大量的自由基，作用于氨基酸链，造成蛋白质氧化损伤、功能丧失，造成细胞损伤[5]。受损的氧化蛋白不能被修复，只能通过蛋白酶体系统降解，如未能被降解，则互相交联成为大分子，失去其原有功能，最终导致酒精性肝病[6]。

蛋白酶体介导的氧化蛋白降解是肝细胞对抗氧化应激的重要机制，蛋白酶体系统可特异性的对病理蛋白进行降解，维持细胞的正常功能[7]。有研究表明蛋白酶体（proteasomes，PS）可高效、高选择性降解体内绝大部分的氧化蛋白[9]，如该系统功能下降，则直接导致氧化蛋白累积并形成聚合体，使得细胞无法正常工作，诱导细胞坏死[10]。本实验结果显示灌酒6周时开始出现肝细胞形态改变及生化指标损害，至12周时病变明显。本实验的前期研究也表明随摄酒增多，大鼠肝细胞氧化蛋白含量明显升高，蛋白酶体活性亚基表达下降，表明酒精可造成蛋白酶体活性降低从而引起细胞氧化损伤，氧化蛋白蓄积，破坏细胞稳态，造成细胞损伤。

表2　各组大鼠蛋白酶体POMP基因表达情况（x±s）Table 2　Expression of POMP mRNA in different groups(x±s)

POMP在蛋白酶体的组装过程中发挥重要作用，其只在前体中被检测到，装配完成后即降解掉。蛋白酶体前体包括α环、β环及POMP，装配过程中POMP的存在使得β亚基活化位点被激活，从而无活性的前体被催化成活性中心颗粒[11]。有研究表明，向细胞内加入蛋白酶体抑制剂MG132后可测得大量的POMP、未加工的前体成分，同时蛋白酶体活性下降。在敲除POMP基因的细胞内也可观察到α环、β环正常，但成熟的蛋白酶体明显减少，表明POMP在蛋白酶体成熟过程中的重要作用［12］。本实验也证实随着酒精摄入时间的延长及摄入量的增加，蛋白酶体成熟蛋白POMP逐渐增多，蛋白酶体成熟障碍、功能下降从而使得肝细胞蛋白质氧化损伤导致的氧化蛋白降解受损，造成氧化蛋白蓄积，即蛋白酶体活性的下降与POMP的表达密切相关。

综上分析，酒精摄入可影响蛋白酶体成熟，使得蛋白酶体功能下降，造成氧化蛋白蓄积，导致细胞损伤。酒精导致的蛋白酶体成熟机制异常在蛋白酶体功能下降中起重要作用。对其机制的进一步研究将有助于寻找改善蛋白酶体功能的新的途径。

参考文献

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［2］Nassir F，Ibdah JA.Role of mitochondria in alcoholic liver disease［J］.World J Gastroenterol，2014，20（9）：2136-2142.

［3］Bardag⁃Gorce F.Effects of ethanol on the protea⁃some interacting proteins［J］.World J Gastroenter⁃ol，2010，16（11）：1349-1357.

［4］张莉，阎明，朱萍，等.酒精性肝病羰基应激状态下蛋白酶体LMP7亚基表达研究［J］.山东大学学报，2007，45（8）：747-777.

［5］Galligan JJ，Smathers RL，Fritz KS，et al.Protein car⁃bonylation in a murine model for early alcoholic liv⁃er disease［J］.Chem Res Toxicol，2012，25（5）：1012-1021.

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［11］Gu ZC，Enenkel C.Proteasome assembly［J］.Cellular and Molecular Life Sciences，2014，71（24）：4729-4745.

［12］Hirano Y，Hendil KB，Yashiroda H.A heterodimeric complex that promotes the assembly of mammalian 20S proteasomes［J］.Nature，2005，437（27）：1381-1385.

2.山东大学齐鲁医院消化内科，山东，济南250012★通讯作者：阎明，E⁃mail：yanming011@126.com

基金项目：山东省医药卫生科研重点项目（2007Hz056）

作者单位：1.东莞东华医院消化内科，广东，东莞523000

Effect of alcohol on proteasome assembly in hepatic tissue

ZHANG Li1,YAN Ming2★,JIANG Di1,SUN Xianjiu1,ZUO Haijun1,LIU Meihong1
(1.Department of Gastroenterology,Donghua Hospital,Dongguan,Guangdong,China,523000;2.Department of Gastroenterology,Qilu Hospital,Shandong University,Jinan,Shandong,China,250012)

［ABSTRACT］ObjectiveTo evaluate the expression of proteasome maturation protein(POMP)in the rat models of alcoholic liver,and investigate the effect of alcohol on proteasome assembly.Methods Establish the rat models of alcoholic liver disease by gastric perfusion method,and kill the rats after 6,8,10,12 weeks.The expressions of mRNA for POMP were detected by fluorogenic quantitative polymerase chain reaction.ResultsThe expressions of mRNA for POMP increased gradually along with the increase of alcohol administration.ConclusionAlcohol administration resulted in the assembly of proteasome.Ethanol induced proteasome malfunction might be responsible for the obstacles of proteasome mature mechanism.

［KEY WORDS］Rat;Alcoholic liver disease;Proteasome;Proteasome maturation protein;Protein oxidative damage