耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌耐药基因检测及分析

涂海健　陈淑娟　林群英　许光辉



耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌耐药基因检测及分析

涂海健1★陈淑娟1林群英2许光辉1

［摘要］目的分析耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KPN）耐药情况与耐药相关基因的关系，了解其耐药机制。方法采用PCR技术检测29株碳青霉烯类耐药KPN与产碳青霉烯酶、超广谱b⁃内酰胺酶（extended⁃spectrumb⁃lactamases，b⁃ESBLs）、ampC酶及喹诺酮类耐药相关基因blaKPC⁃2、blaIMP⁃4、blaCTX⁃M、blaCTX⁃M⁃15、blaVIM⁃1、blaTEM、blaSHV、ampC、gyrA、parC，并对KPC⁃2、ampC、gyrA基因进行序列分析。结果用PCR技术证实了29株为产KPC、IMP型碳青霉烯酶的KPN，并且携带TEM、SHV型b⁃ESBLs，其中18株同时编码ampC基因；29株待测菌均检出喹诺酮类耐药相关gyrA、parC基因。KPC基因片段同源性分析显示，待测菌株之间核苷酸同源性为98%~100%，氨基酸同源性为97%~100%；与肺炎克雷伯氏菌Kpn⁃1504株之间的核苷酸同源性最高，为99%~100%。gyrA、parC基因突变率分别为58.6%、62.1%。结论产KPC⁃2、IMP⁃4型碳青霉烯酶同时携带多种b⁃ESBLs、ampC基因及突变的喹诺酮类耐药相关gyrA、parC基因的KPN耐药情况更加严重，同时存在克隆性流行可能。

［关键词］肺炎克雷伯菌；blaKPC；超广谱b⁃内酰胺酶；基因；PCR

随着耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KPN）出现和临床检出不断增多，给临床抗感染治疗和医院内感染控制带来极大的困难，严重威胁人们的健康［1］。本研究对莆田学院附属医院检出29株耐碳青霉烯类抗生素KPN进行耐药基因检测和分析，旨在本院耐碳青霉烯类抗生素KPN的耐药机制和，为控制和预防耐碳青霉烯类抗生素药菌KPN提供依据。

1　材料和方法

1.1菌种来源

收集2013年6月至2014年6月学院附属医院临床科室送检标本。质控菌株部临床检验中心提供肺炎克雷伯菌ATCC⁃73、大肠埃希氏菌ATCC⁃25922、铜绿假单脆菌ATCC⁃27853。

1.2主要试剂和仪器

法国生物梅里埃公司生产的VITEK⁃2 Com⁃pact全自动细菌鉴定、药敏分析系统及配套GN鉴定卡、AST⁃13药敏卡；英国OXOID公司生产的药敏纸片；德国QIAGEN公司生产飞Taq PCR Mas⁃ter Mix Kit；美国Life Technologies公司生产的VeritiTM 96孔梯度PCR仪。

1.3药敏试验

采用VITEK⁃2 Compact药敏分析系统及K⁃B纸片扩散法进行药敏试验，结果严格按美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Stan⁃dards Institute，CLSI）（2010M100⁃S20）的抗微生物药物敏感性试验操作方法和判断标准。

1.4碳青霉烯酶筛选

1.4.1改良Hodge法

将0.5麦氏单位的大肠埃希菌ATCC25922均匀涂布在MH平板上，中间贴亚胺培南的纸片（10 μg/片），将实验菌株以亚胺培南纸片为起点，沿离心方向划线，35℃培养过夜，抑菌圈内呈出现矢状者为阳性，并设阴阳性对照。

1.4.2EDTA协同试验

取0.5麦氏单位的待测菌均匀涂布在MH平板上，贴美罗培南纸片（10 μg/片），在距离1 cm地方贴一空白纸片，在其上面滴加0.5 mmol/L的EDTA 4 μL，35℃培养过夜，观察美罗培南抑菌圈在在靠近EDTA纸片侧明显扩大即为产金属酶菌。

1.5耐药基因DNA提取

挑取3~6个新鲜菌落，采用核酸提取试剂盒（硅胶膜⁃离心柱法）（中山大学达安基因股份有限公司），严格按说明书操作进行耐药相关基因DNA提取。

1.6耐药基因PCR检测

PCR引物设计合成：GenBank上查找目的基因DNA序列，采用Primer express 2.0软件在编码序列（coding sequence，CDS）区进行特异性引物设计，引物合成由中山达安基因公司通过ABI 3900台式高通量DNA合成仪合成，具体见表1。

PCR反应体系配制：按QIAGEN Taq PCR Master Mix Kit试剂盒说明书要求进行，Taq PCR Master Mix 50 μL，F上游引物1 μL，R下游引物1 μL，模板核酸10 μL，ddH2O 38 μL，共100 μL。PCR扩增条件：94℃预变性3 min；变性94℃30 s，退火55℃30 s，72℃1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。取PCR产物在新鲜配制2%琼脂糖凝胶，以Thermo⁃100bp⁃Marker为对照进行电泳，结果见图1。

1.7序列测定与分析

1.7.1测序PCR体系配制

PCR产物10 ng，测序buffer 3 mL，BigDye 2 mL，测序引物（表1）1 mL，去离子水补到20 mL。按下述条件进行PCR反应：预变性96℃5 min；变性94℃30 s，退火60℃45 s，72℃45 s，40个循环；延伸72℃10 min；4℃保存。

1.7.2测序产物纯化

每管分别加入2 mL 125 mmol EDTA和2 mL 3 mol NaAc到管底；再加入50 mL 100%酒精，震荡混匀，避光室温放置15 min；12 000 rpm离心30 min，去上清；每管加入150 mL 70%冷酒精，12 000 rpm离心15 min，去上清（重复1次）。室温阴干酒精，加入10 mL Hi⁃Di Formamide振荡溶解DNA。溶解后的样品在95℃变性5 min，迅速置冰中冷却至少2 min后上仪器测序。

1.7.3基因分析仪测序

纯化后的测序产物加入与基因分析仪配套的96孔板，盖好，记录加样顺序。用ABI公司Data Collection®软件进行数据收集得到ab1、hd1及seq格式的文件。KPC⁃2序列采用cluster W软件进行同源性分析。gyrA、parC序列用chromas软件作BLAST Search比对。

表1　靶基因引物和目的产物长度Table 1　Primer sequencing of targeted genes and length of target products

2　结果

2.1耐碳青霉烯类抗生素KPN耐药情况

对碳青霉烯类抗生素亚胺培南、厄他培南耐药的29株菌株进行耐药基因研究，具体结果见表2。

2.2碳青霉烯酶筛选结果

29株标本改良Hodge法和EDTA协同试验均为阳性，提示待测菌株产碳青霉烯酶和金属酶。

2.3耐药基因PCR检测结果

PCR扩增产物电泳结果见图1，相应产物长度（bp）见表1，琼脂糖凝胶电泳图中1、8、10号结果阴性对应的基因为CTX⁃M⁃15、CTX⁃M、VIM⁃1；2号结果显示2条电泳条带分子量约520 bp对应的是ampC基因，分子量约200~300 bp条带可能污染导致，其他扩增产物都在相应位置显示阳性结果。

2.3.1产超广谱b⁃内酰胺酶基因

29株耐碳青霉烯类抗生素KPN都检出bla⁃TEM、blaKPC、blaSHV、blaIMP耐药基因，CTX⁃M、CTX⁃M⁃15、VIM⁃1未检出。

2.3.2产ampC酶基因检出情况

共检出18株耐碳青霉烯类抗生素KPN ampC耐药基因，检出率为62.1%（18/29）。

表2　耐碳青霉烯类抗生素KPN耐药情况Table 2　The resistance of carbapenem⁃resistant KPN

2.3.3耐喹诺酮类药相关基因

29株待测菌均检出gyrA、parC基因。

2.4耐药基因序列分析

2.4.1KPC⁃2基因片段同源性分析

同源性比较结果显示：待测菌株之间核苷酸同源性为98%~100%，氨基酸同源性为97%~100%；与肺炎克雷伯氏菌Kpn⁃1504株之间的核苷酸同源性最高，为99%~100%，与肺炎克雷伯氏菌Kpn⁃1504株氨基酸同源性最高，为96%~99%。

2.4.2KPC⁃2基因序列进化树分析

将待测菌株与GenBank中发布的菌株序列构建进化树（图2）。

2.5gyrA、parC基因突变分析

对gyrA、parC基因序列（图3和图4）分析发现gyrA基因突变率为58.6%（17/29）、parC基因突变率为62.1%（18/29）。基因突变主要集中在gyrA编码基因第83、87位密码子和parC编码基因80位密码子上。

3　讨论

自2001年美国首次报道产碳青霉烯酶的KPN［2］，随着碳青霉烯类药物在临床上广泛使用，碳青霉烯类耐药KPN检出不断增多［3⁃4］，有关碳青霉烯酶的耐药机制的研究已成为国内外关注的焦点［5⁃6］。本研究29株耐碳青霉烯类抗生素KPN对亚胺培南耐药，对其他抗菌药物包括加酶抑制剂在内临床常用的几乎所有β⁃内酰胺类药物耐药（舒普深耐药96.6%除外），对所有氟喹诺酮类和氨基糖苷类药物耐药，仅对米诺环素和多粘菌素B敏感，表现为多重耐药或泛耐药菌，KPN此表现对多种抗生素的耐药率均高达100%，较为罕见，可能与研究对象选择导致的差异性有关，有待进一步研究。

对29株耐碳青霉烯类抗生素KPN相关耐药基因检测，发现其同时存在分别编码非金属、金属型碳青霉烯酶的KPC⁃2和blaIMP基因，宁长秀［7］和Wei等［8］也有报道检测出同时产KPC⁃2和IMP⁃4酶的KPN株，认为其会导致KPN耐药更强，也证明了产碳青霉烯酶是KPN耐碳青霉烯类抗菌药物主要原因。

29株耐碳青霉烯类抗生素KPN菌还检测出携带编码产β⁃内酰胺酶的blaTEM、blaSHV基因，其中18株同时检测出ampC酶基因，说明耐碳青霉烯类抗生素KPN存在多种耐药基因积聚共存现象，高丽华等［9］从耐碳青霉烯类抗生素KPN菌中检测出3株同时编码ESBL和ampC基因，其中2株携带3种β⁃内酰胺酶基因，Ogbolu［10］和赵晓杰等［11］也认为产β⁃内内酰胺酶的细菌往往同时携带其他种类抗菌药物的耐药基因。这种产生碳青霉烯酶和多种β⁃内酰胺酶出现在单一细菌中，给临床抗感染治疗带来到很大困难。

所研究29株菌都表现氟喹诺酮类抗生素耐药，目前认为氟喹诺酮类耐药决定区（quinnlone re⁃sistance determing region，QRDR）编码DNA旋转酶gyrA基因及编码拓扑异构酶parC基因突变与氟喹诺酮类耐药相关［12］。29株碳青霉烯类耐药的KPN均检测出gyrA、parC基因，但gyrA、parC基因突变率分别为58.6%、62.1%，无法解释所有研究菌株都表现氟喹诺酮类抗生素耐药，说明氟喹诺酮类耐药还有其他机制导致。

对所检测菌株的KPC⁃2基因与Genbank进行BLAST比较发现铜绿假单菌（NG036544.1）、大肠埃希菌（KR052097.1）、粘质沙雷氏菌（CP011639.1）、阴沟肠杆菌（CP008901.1）、弗氏柠檬酸杆菌（KP987215.1）等菌的质粒均检出相同的基因其同源性达99%，说明质粒介导产碳青霉烯酶基因可在不同菌种中传播，Qi等［13］认为编码KPC⁃2和IMP⁃4酶的基因位于可移动质粒上，可通过耐药基因水平和克隆播散，在不同菌种之间转移，造成医院内暴发流行；对待测菌株之间同源性分析，结果显示核苷酸同源性为98%~100%，氨基酸同源性为97%~100%；与肺炎克雷伯氏菌Kpn⁃1504株之间的核苷酸同源性最高，为99%~100%，提示存在克隆性流行可能。

综上耐碳青霉烯类抗生素KPN是多种耐药机制导致，不仅产blaKPC⁃2、blaIMP⁃4型碳青霉烯酶同时携带b⁃ESBLs、ampC基因及突变的喹诺酮类耐药相关gyrA、parC基因，从而使其耐药情况更加严重；29株研究菌blaKP⁃2C基因同源性高提示医院存在质粒介导克隆性耐药基因流行可能。

参考文献

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2.莆田学院附属医院呼吸内科，福建，莆田351100★通讯作者：涂海健，E⁃mail：tufangshu@126.com

基金项目：福建省莆田市科技计划［2013S03（4）］

作者单位：1.莆田学院附属医院检验科，福建，莆田351100

Detection and analysis of the drug resistant genes associated with carbapenem⁃resistantKlebsiella pneumoniae

TU Haijian1★，CHEN Shujuan1，LIN Qunying2，XU Guanghui1
（1.Department of Laboratory Medicine，Affiliated Hospital of Putian College，Putian，Fujian，China，351100；2.Department of Respiratory Medicine，Affiliated Hospital of Putian College，Putian，Fujian，China，351100）

［ABSTRACT］ObjectiveTo analyze the relationship between the resistance of carbapenem⁃resistant Klebsiella pneumoniae(KPN)and the related gene of drug resistance,and to understand the mechanism of drug resistance.MethodsThe genes of blaKPC⁃2,blaIMP⁃4,blaCTX⁃M,blaCTX⁃M⁃15,blaVIM⁃1,blaTEM, blaSHV,ampC,gyrA and parC of quinolone⁃resistance were detected by polymerase chain reaction(PCR), which related producing carbapenemase,extended⁃spectrumb⁃lactamases(b⁃ESBLs),ampC enzyme in 29 strains of carbapenem⁃resistant pneumonia Klebsiella.And Kpc⁃2,parC and gyrA were performed by DNA sequencing.Results29 strains of KPN producing KPC and IMP type of carbapenemase were identified by PCR at the same time.They also carried blaTEM and blaSHV genes of beta⁃ESBLs,among which 18 strains encoded AmpC gene.In addition,gyrA and parC gene were detected in all strains.KPC gene fragment homologous analysis showed that the tested strains between nucleotide homology was 98%to 100%,while the homology of amino acid is 97%~100%.They showed the highest nucleotide homology of 99%~100%withReber Ƴ s bacteria Kpn⁃1504 strains.The gene mutation rate of gyrA and Parc were 58.6%and 62.1%, respectively.ConclusionThe resistant situation of KPC⁃2,IMP⁃4 type carbapenemase producing KPN which were carrying a variety ofb⁃ESBLs,AmpC genes and mutation of resistance to quinolones gyrA and Parc genes is more serious,while there may exist the clonal epidemic.

［KEY WORDS］Klebsiella pneumoniae;blaKPC;Extended⁃spectrumb⁃lactamases;Gene;PCR