法医学常用15个STR基因座的突变分析

邱平明　　陈玲★　　余嘉欣　　陆慧洁　　牛牧斐　　刘超,2



•论著•

法医学常用15个STR基因座的突变分析

邱平明1陈玲1★余嘉欣1陆慧洁1牛牧斐1刘超1,2

［摘要］目的观察Sinofiler系统15个短串联重复序列（short tandem repeat，STR）基因座的突变现象和特点。方法选择Sinofiler试剂盒检测的案件8 261例，筛选该试剂盒15个STR基因座的突变事件，判断突变等位基因的来源，统计各基因座的突变率，分析突变的特点。结果在15个基因座上发现175个突变事件，167例（95.43%）为一步突变，5例（2.86%）为二步突变，2例（1.14%）为三步突变，1例（0.57%）为五步突变。平均突变率为1.30×10-3（95%CI 1.12×10-3~1.51×10-3），各基因座的突变率介于0.45×10-3~2.56×10-3。父、母来源突变比例为13.33∶1。增加重复单位和减少重复单位的突变事件比值为1.10∶1。15个基因座的突变率与杂合度之间没有统计学上的相关性。结论获得的15个STR基因座突变资料在亲子鉴定中有重要的应用价值。

［关键词］法医物证学；短串联重复序列（STR）；突变

短串联重复序列（short tandem repeat，STR）具有高度多态性，被广泛用于个体识别和亲子鉴定。Sinofiler检测试剂盒针对中国汉族人群的特点，将国际范围广泛应用的Identifiler试剂盒中的TH01、TPOX基因座替换为D12S391、D6S1043基因座，对中国汉族人群的亲权鉴定具有极高的使用价值［1］。D12S391和D6S1043比TH01、TPOX具有更高的多态性［2］。然而，高多态性常与高突变率并存。了解STR基因座的突变率和突变特点有利于亲子鉴定实践更准确、科学地进行结果评估。获得常用STR基因座准确的突变率需要基于大样本的研究数据。本文通过大样本分析，对Sinofiler系统15个STR基因座的突变进行系统研究，报道如下。

1　材料和方法

1.1样本材料

从南方医科大学司法鉴定中心日常检案中选择Sinofiler试剂盒检测并肯定亲权的亲子鉴定案件8 261例，其中三联体709例，父子二联体6 726例，母子二联体826例。样本包括人体血样（17.4%）、唾液斑（74.1%）、带毛囊毛发（5.8%）、羊水（1.9%）、精斑（0.6%）、组织（0.3%）。

1.2仪器与试剂

9700扩增仪（ABI，美国）；3130xL基因分析仪（ABI，美国）；AmpFLSTR®SinofilerTM试剂盒（ABI，美国）；STRtyper⁃10G试剂盒（珠海科登生物科技有限公司）；AmpFLSTR®YfilerTM试剂盒（ABI，美国）；Investigator Argus X⁃12试剂盒（QIAGEN，德国）。

1.3DNA提取与STR检测

采用chelex⁃100法提取DNA，扩增体系和热循环反应按试剂盒说明书进行，扩增产物在3130xl基因分析仪电泳，GeneMapper ID v3.2软件进行基因分型。

1.4突变基因座、突变来源和突变步数的确定

用Sinofiler体系进行检测，若违反遗传规律基因座总数＜3，参照亲权鉴定技术规范［3］计算亲权指数（paternity index，PI）、增加检测STRtyper⁃10G系统，并增加X⁃STR或Y⁃STR检测。若PI>10 000，且X⁃STR或Y⁃STR不违反遗传规律，则认定亲子关系，违反遗传规律的基因座视为是突变基因座。

参照文献［4］确定突变等位基因的来源：将孩子中的突变等位基因与发生突变的父方或母方等位基因相比较，相差步数最小的等位基因是突变的等位基因；若相差的步数相同，则判为来源不明。突变步数为重复单位的增加或减少，若同时存在增加或减少同步数的可能则判为不确定。短、中、长等位基因的确定参考文献［5］。

1.5统计分析

用confint.xls软件（http：//statpages.org/confint. html）计算突变率以及95%CI值。SPSS 13.0软件进行Spearman相关性分析。

2　结果

2.1突变率和突变来源

在8 261例认定亲子关系案例中，观察8 970次减数分裂，共发现175个突变事件。15个STR基因座的突变率见表1，其中D12S391基因座的突变率最高，vWA次之，D2S1338和D19S433的突变率最低。175个突变事件中，父系突变的有160个（91.43%），母系突变的有12个（6.86%），其余3个（1.71%）不能确定突变来源。父系突变与母系突变的比例为13.33∶1。

表1　15个STR基因座的突变来源和突变率Table 1　Mutation resource and mutation rate of 15 STR loci

2.2突变类型、突变步数和突变方向

本研究所观察到的175例突变家系中，均为单基因座突变。其中一步突变167例（95.43%），二步突变5例（2.86%），三步突变2例（1.14%）和五步突变1例（0.57%）。

65例表现为重复序列的增加，59例表现为重复序列的减少，另有51例不能确定增加或减少。重复序列增加与重复序列减少的比例为1.10∶1。

2.3突变与等位基因长度的关系

可确定突变中重复序列增减共124例。其中短、长等位基因突变例数分别为14例（11.3%）、31例（25%），而中等位基因突变例数为79例（63.7%），见表2。中等位基因中重复序列增加和减少的比例为1.08∶1；短等位基因中重复序列减少与重复序列增加的比例为3.67∶1；长等位基因中重复序列增加与重复序列减少的比例为2.88∶1。

表2　不同长度等位基因发生重复序列增加或减少的次数Table 2　Allele sizes versus number of repeat gain/loss

2.4杂合度与突变率的关系

15个STR基因座的杂合度与突变率情况见表3，多数基因座表现为杂合度高，突变率也高。但个别存在差异。如D6S1043基因座表现为最高的杂合度，但突变率仅为0.000 89。Spearman’s test显示15个STR基因座的突变率与杂合度之间没有显著的相关性。

3　讨论

本研究获得的15个STR基因座的突变率介于0.45×10⁃3~2.56×10⁃3，其中D12S391基因座的突变率最高，其次为vWA、FGA和D18S51，D2S1338 和D19S433基因座的突变率最低。这可能与基因座内重复序列的结构有关［6⁃7］。亲权鉴定技术规范规定用于亲权鉴定的遗传标记的突变率应低于0.002［3］。本研究所选取的案例中除了D12S391、vWA、FGA、D18S51基因座突变率大于0.002外，均符合此规律，因此采用这些STR基因座进行亲权鉴定时应注意其高突变率。

复制滑链错配学说是目前普遍接受的突变机制［8］。在DNA复制过程中，新生链复制到模板链的STR序列区域时，由于序列是重复的，因此很容易发生碱基错配，形成一个或数个重复序列的环状结构。如果继续复制下去，就会出现新生链比模板链加长或缩短的现象。即每个突变都是增加或减少一个或几个重复单位。然而，对于STR突变模式有2种不同的观点：一种是简单突变模式，即等位基因的突变，无论是延长或收缩多少个重复单位都是一步完成。另一种是逐步突变模式，即突变是经过多步才能完成，每一步只是增加或减少一个重复单位，每一步都有一定的发生率，步数越多的，发生的机会就越少，这种观点为多数学者认可。本研究符合逐步突变模式，观察到一步突变167例，占总数的95.43%。此外，研究结果还显示重复单位增加和减少的比例约为1.1∶1。这表明在STR基因突变中重复序列的增加和重复序列的减少是有差异的，增加比减少更为常见，这与陈玲［5］、李茜等［9］研究结果相符合。本研究观察到罕见的三步突变2例、五步突变1例，且排除是引物结合点变异导致的等位基因丢失，确认为突变。目前有文献报道过三步突变［10-11］、四步突变［12-13］。总体来看，多步突变发生的机率很低，判断多步突变需慎重。

本研究显示来自父系和母系来源的突变比例为13.33∶1，具有明显性别差异。突变与干细胞发生过程中细胞所经过的分裂次数有关。男性精母细胞分裂成精子需要的分裂次数比女性配子细胞成熟需要的次数要多得多，因此突变发生在男性的概率更大。与其他研究相比，刘素娟等［14］观察10 000个三联体亲子鉴定，发现PowerPlexTM16系统15个STR基因座的父、母源突变比值为3.57∶1。Qian［15］发现15个STR基因座的父、母源突变比例为5.2∶1，其观察的减数分裂次数男女比例为2.6∶1。帅莉等［16］报道父系和母系来源的突变比例为10∶1，但未指明父源、母源的等位基因传递次数。上述研究与本研究数据存在较大差异。产生这种现象的结果可能与不同研究的群体结构、样本数量有关。本研究样本人群主要以二联体为主，二联体中又以父子二联体为主，父源、母源等位基因传递次数的比值为4.84∶1，因此表现为父源突变比例偏高。

突变与等位基因长度关系的研究结果显示突变主要发生在中等位基因，且重复序列增加和重复序列减少的例数接近。长等位基因（重复次数多的等位基因）发生的突变案例中大部分表现为重复单位的减少，可见长等位基因基因的突变倾向于缩短。短等位基因（重复次数少的等位基因）发生突变的概率最低，14例中有11例表现为重复单位的增加，提示短等位基因的突变倾向于延长。这表明STR等位基因的突变存在自控性，防止等位基因的无限变大或无限变小，从而支持等位基因的种类稳定，这与Lu等［17］的研究结果一致。

参照文献［18］获得本研究人群15个STR基因座的杂合度数据，并研究杂合度和突变率之间的相关性，结果表明杂合度与突变率之间无统计学上的相关性，这与Leopoldino［19］的研究结果一致。由于不同群体结构、样本数量和每个STR基因座的结构特征存在差异，表现为杂合度、突变率各不相同。因此，进行亲子鉴定时，应注意此现象的存在，尽量选取多态性高、突变率低的基因座进行鉴定。

STR突变是法医物证鉴定中经常遇到的情形，而且是一个不可忽视的风险因素。为降低误判风险，建议做好以下几方面：（1）询问案情，如了解争议父或争议母与孩子之间是否有亲缘关系（如爷孙、姑侄关系等），若二者有亲缘关系，那争取两位可疑的父亲或母亲都参与鉴定。（2）若单亲出现突变，尽量追加父方或母方样品检测。（3）根据情况增加性染色体STR、SNP和（或）INDEL、线粒体DNA等其他遗传标记，必要时可应用二代测序技术辅助鉴定。

表3　杂合度与突变率的关系Table 3　The relation of heterozygosity and mutation rate for 15 STR loci

参考文献

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2.广州市刑事科学技术研究所，广东，广州510030

★通讯作者：陈玲，E⁃mail：lingpzy@163.com

基金项目：广东省医学科学技术研究基金（A2015043）

作者单位：1.南方医科大学基础医学院法医学系，广东，广州510515

Mutations of 15 Short Tandem Repeat Loci for forensic application

QIU Pingming1,CHEN Ling1★,YU Jiaxin1,LU Huijie1,NIU Mufei1,LIU Chao1,2
(1.Department of Forensic Medicine,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong,China,510515; 2.Guangzhou Forensic Science Institute,Guangzhou,Guangdong,China,510030)

［ABSTRACT］ObjectiveTo analyze the characteristics of 15 STR loci mutations and their roles in paternity tests.Methods8 261 confirmed parentage cases detected by Sinofiler System were analyzed.The mutation events in 15 STR loci of Sinofiler System were screened,and the sources of mutant alleles were analyzed.Finally,the mutation rates of STR loci were calculated and the features of these mutations were examined.Results175 mutation events were observed in 15 STR loci.Among them,167(95.43%)were one⁃step,5(2.86%)were two⁃step,one(1.14%)was three⁃step and one(0.57%)was five⁃step.The overall mutation rate was 1.30×10-3（95%CI 1.12×10-3~1.51×10-3）,and the locus⁃specific mutation rates ranged from 0.45×10-3~2.56×10-3.The ratio of paternal versus maternal mutation was 13.33:1．The ratio of repeat gains versus repeat losses was 1.10:1.No statistical correlation between mutation rate and heterozygosity at 15 STR loci was detected.ConclusionMutations in the 15 STR loci can play a valuable role in paternity tests.

［KEY WORDS］Forensic biological evidence;Short tandem repeat(STR);Mutation