地中海贫血实验室筛查指标评价

陈熙　肖克林　罗茗月　麦光兴　夏勇



地中海贫血实验室筛查指标评价

陈熙肖克林★罗茗月麦光兴夏勇

［摘要］目的探讨多项实验室指标用于筛查地中海贫血（简称地贫）基因携带者的临床应用价值。方法选取在深圳市宝安区妇幼保健院体检、婚检和产检的人员1 373例，对其均进行血常规血细胞分析、血红蛋白成份分析和地贫基因诊断。以基因诊断为金标准，对已明确诊断的α⁃地贫组548例、β⁃地贫组248例、α⁃合并β⁃地贫组33例和非地贫组544例，进行红细胞参数［红细胞数量（red blood cell count，RBC）、血红蛋白（hemoglobin，HB）含量、红细胞压积（hematocrit，HCT）、平均红细胞体积（mean corpuscular volume，MCV）、平均血红蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）、平均血红蛋白浓度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）和血红蛋白A2（hemoglobin A2，HbA2）含量］比较；计算MCV、MCH和HbA23项血液学指标联合筛查结果的灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值。结果地贫组与非地贫组比较，地贫组HB、HCT、MCV、MCH和MCHC均减低，差异均有统计学意义（P<0.05）。与非地贫组相比较，β地贫组HbA2值明显升高（P<0.05）。MCV与MCH 2项平行联合筛查地贫的灵敏度及特异度分别为94.0%和82.9%；MCV、MCH和HbA2⁃HPLC 3项平行联合筛查地贫的灵敏度及特异度为97.7%和39.2%。结论HbA2定量分析是筛查β⁃地贫极有价值的实验室指标，但对于筛查α⁃地贫敏感性较差，漏检率高。MCV、MCH两者平行联合或与HbA2⁃HPLC三者平行联合筛查有较高的检测灵敏度，但特异度不甚理想。因此在进行地贫筛查时，需综合分析实验室各项指标，以降低漏诊率。

［关键词］地中海贫血；平均红细胞体积；平均血红蛋白含量；血红蛋白

地中海贫血（简称地贫）是由于珠蛋白基因突变导致肽链表达失衡而产生的单基因常染色体隐性遗传性贫血病［1］。根据生成减少的珠蛋白链种类将地贫分为α⁃、β⁃、δβ⁃和δ⁃型地贫等类型，其中α⁃和β⁃地贫较为常见。本病高发于地中海沿岸和东南亚各国，在我国多分布于广东、广西、海南、四川等省区［2］。该病危害大［3］，重型地贫患者绝大多数于儿童期死亡。目前通过实验室方法对地贫进行筛查和产前基因诊断是杜绝重型地贫患儿出生的有效措施。地贫的常规实验室筛查项目主要为血液学检查内容，包括红细胞参数、血红蛋白分析等［4］。地贫基因诊断则是确诊该病的金标准［5］，一般基于PCR、核酸杂交、基因芯片和DNA测序等技术。为合理选择实验室检查项目和方法进行地贫筛查，本研究对筛查地贫的各项实验室指标［红细胞数量（red blood cell count，RBC）、血红蛋白（hemoglobin，HB）含量、红细胞压积（hematocrit，HCT）、平均红细胞体积（mean corpuscular volume，MCV）、平均血红蛋白含量（mean corpuscular hemo⁃globin，MCH）、平均血红蛋白浓度（mean corpuscu⁃lar hemoglobin concentration，MCHC）、血红蛋白A2（hemoglobin A2，HbA2）含量］进行系统分析，评价其临床应用价值。

1　资料与方法

1.1一般资料

选取从2012年1月至2013年12月在深圳市宝安区妇幼保健院体检、婚检和产检的人员1 373例，年龄17~48岁，平均年龄为26.9岁，所选研究对象均进行血细胞分析、血红蛋白成份分析和地贫基因诊断。基因诊断确诊地贫基因携带者829例，非地贫患者544例。

1.2仪器与试剂

Coulter LH750血细胞分析仪（Beckman，美国），VariantTMⅡ血红蛋白分析仪（Bio⁃Rad，美国），Mastercycler5331梯度PCR仪（Eppendorf，德国），凝胶成像分析系统（UVI，英国），电泳仪（北京六一仪器厂DYC系列），杂交仪（UVP，美国），全血DNA快速提取试剂盒（深圳亚能生物技术有限公司），α⁃/β⁃地中海贫血基因检测试剂盒（深圳亚能生物技术有限公司），电泳缓冲液：0.5×TBE（深圳亚能生物技术有限公司），琼脂糖（solarbio，西班牙）。

1.3方法

1.3.1红细胞参数检测

采用全自动血细胞分析仪检测红细胞参数，严格执行实验室质控检测。设定成人MCV、MCH正常参考值范围分别为80~95 fL和27~31 pg，取MCV<80 fL、MCH<27 pg为阳性截断值。

1.3.2血红蛋白分析

采用离子交换高效液相色谱（high perfor⁃mance liquid chromatography，HPLC）方法分离红细胞中的血红蛋白成份［6］，根据出峰时间（保留时间）和出峰面积大小来分析不同血红蛋白的成份和含量。实验操作和结果分析均按说明书进行。设定成人HbA2的正常参考值范围为2.5%~3.5%，取HbA2<2.5%或HbA2>3.5%为阳性截断值。

1.3.3地中海贫血基因诊断

首先通过柱式分离法提取全血DNA。再采用gap⁃PCR方法检测中国人群中常见的3种缺失型α⁃地贫（⁃⁃SEA、⁃α3.7与⁃α4.2），采用PCR⁃反向斑点杂交（PCR⁃reverse dot blot，PCR⁃RDB）技术检测常见的3种突变型α⁃地贫（αcsα、αQsα、αwsα）和17种突变型β⁃地贫｛CD41⁃42（⁃TTCT），IVS⁃Ⅱ⁃654（C→T），⁃28（A→G），⁃29（A→G），⁃30（T→C），⁃32（C→A），CD17（A→T），CD31（⁃C），CD43（G→T），CD71⁃72（+A），βE（GAG→AAG），CD14⁃15（+G），CD27/28（+C），IVS⁃Ⅰ⁃1（G→A，G→T），IVS⁃Ⅰ⁃5 （G→C），CAP［CAP+1（A→C）/5’UTR；+43to+40（⁃AAAC）］，Int（ATG→AGG）｝。

1.4统计学处理

计量资料以x±s表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1地中海贫血基因携带率

选取的1 373例产检、婚检及健康体检者中共检出829例地贫基因携带者。其中单纯α⁃地贫基因携带者548例，携带率为39.9%；β⁃地贫基因携带者248例，携带率为18.1%；α合并β地贫基因携带者33例，携带率为2.4%。

2.2地中海贫血基因突变类型

α⁃地贫基因突变类型包括⁃⁃SEA、⁃α3.7、⁃α4.2、αcsα、αQsα、αwsα，其中⁃⁃SEA型最为常见，占66.8%。β⁃地贫共检出11种基因突变类型，其中CD41⁃42（⁃TTCT）和IVS⁃Ⅱ⁃654（C→T）为最常见的突变类型。

2.3血常规红细胞参数比较

统计红细胞6项参数：红细胞计数（RBC）、血红蛋白含量（HB）、红细胞压积（HCT）、平均红细胞体积（MCV）、平均血红蛋白含量（MCH）、平均血红蛋白浓度（MCHC）。α⁃、β、α合并β地贫组的MCV、MCH、MCHC、HB、HCT与非地贫组比较均降低，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1　地贫患者与健康者红细胞参数测定结果比较（x±s）Table 1　The erythrocyte parameters of thalassemia patients and normal subjects（x±s）

2.4HbA2测定结果

与非地贫组比较，β⁃地贫组和α合并β地贫组HbA2值明显升高（P<0.05），α⁃地贫组HbA2轻度降低（P<0.05），见表2。

表2　非地贫组和地贫组HbA2结果比较（x±s）Table 2　HbA2of thalassemia patients and normal subjects（x±s）

2.5MCV、MCH、HbA2联合实验检测

本研究采用MCV、MCH两者平行联合或与HbA2⁃HPLC三者平行联合实验来筛查地贫携带率，当三者平行联合筛查时，灵敏度可达97.7%，但特异度较低，见表3、表4。

表3MCV、MCH、HbA2⁃HPLC平行联合实验筛查地贫阳性例数（n）Table 3　The positive cases of the parallel test for MCV，MCH，HbA2⁃HPLC on screening thalassemia（n）

表4MCV、MCH、HbA2⁃HPLC平行联合实验检测地贫的评价指标（%）Table 4　The effectiveness of the parallel test for MCV，MCH，HbA2⁃HPLC on screening thalassemia（%）

3　讨论

重型地贫患者需终生靠输血和去铁治疗维持，因此通过选择性引产是预防重型地贫患儿出生的有效对策［7］。深圳是个移民城市，城市人员来自不同地区，为做好地贫基因产前诊断和遗传咨询工作，首先需了解这一区域地贫基因的常见缺失和突变类型。在本研究所选受检对象中，α⁃地贫携带率最高的为东南亚缺失型，这也是我国南方最主要缺失型［8］；CD41⁃42（⁃TTCT）和IVS⁃Ⅱ⁃654（C→T）为常见β⁃地贫基因突变类型，同广东省其他地区报道的类似［9］；α合并β复合型地贫的携带率为2.4%，高于广州报道的0.37%［10］，可能与选择的人群不同有关。

目前，实验室地贫筛查项目一般包括红细胞参数检测，红细胞渗透脆性试验、血红蛋白组分分析和血清铁代谢检测等。为建立准确、快速地筛查模式，本研究系统评价实验室各项地贫筛查指标，以简化诊断策略。红细胞参数检测对发现贫血有重要意义，一般患者MCV<80 fL，MCH<27 pg提示其可能是患缺铁性贫血或为地贫基因携带者，并且MCV和MCH的减低程度与地贫类型和贫血严重性相关［11］。MCV及MCH等红细胞参数在地贫筛查中日益受到重视，已被国内外普遍应用于地贫筛查。本研究中地贫基因携带者和正常对照组的红细胞参数各项指标有明显差异，地贫组的MCV和MCH均降低（P<0.001），β⁃地贫组、α合并β复合型地贫组较α⁃地贫组降低更为明显。但需要注意，缺铁性贫血同样可能造成小细胞低色素性贫血，MCV、MCH值也会降低，这会造成地贫筛查时假阳性增高，临床中可以通过检测血清铁和铁蛋白进行排除。

血红蛋白组分分析是地贫筛查中重要检查项目［12］。常用的血红蛋白分析技术有琼脂糖凝胶电泳、高效液相色谱法（HPLC）、毛细管电泳（capil⁃lary electrophoresis，CE）等。HPLC重复性好、操作简便是定量检测HbA2及HbF和分离鉴定异常血红蛋白的优良方法［13］。HbA2是筛查地贫极有价值的指标，当HbA2大于3.5%提示携带β⁃地贫可能性大，而α⁃地贫的HbA2值一般小于2.5%。本研究中，β⁃地贫组HbA2值明显高于非地贫组，灵敏度、特异度、准确率较高。α⁃地贫组HbA2值相对非地贫组轻度降低，且有30.5%的α⁃地贫基因携带者HbA2含量正常，因此HbA2定量分析用于α⁃地贫筛查时敏感性差，漏检率高。此外，在研究中发现α合并β地贫组的HbA2值相对正常对照组显著增高，筛查如果仅靠HbA2单项指标评估会造成漏诊，实验室人员不能因为HbA2值升高而忽视了β合并α的复合型地贫类型，需结合其他指标进行分析，避免漏诊。

本研究中采用MCV、MCH两者平行联合或与HPLC三者平行联合筛查地贫，可以降低单项检测的假阴性率，提高检测阳性病例的灵敏度，用于地贫筛查时漏诊率低，但特异度相对较差，进一步确诊需要做基因分析。基因诊断方法因地贫的不同类型而异。对于已知的地贫基因检测，实验室常用技术为gap⁃PCR、PCR⁃RDB、实时PCR熔解曲线分析等［14］。gap⁃PCR可以检测缺失和重排，是诊断缺失型地贫的常规方法。PCR⁃RDB能同时检测多个位点突变，多用作突变型地贫诊断。近年来实时PCR熔解曲线分析正逐渐受到人们的关注，其主要有荧光标记探针熔解曲线和高分辨熔解曲线2种分析技术，具有灵敏度高，特异性强等优点，适合临床应用推广。而DNA测序技术用来检测未知地贫突变基因结果准确，但操作繁琐，成本较高，可以选择作为罕见病例确证的方法。

综上所述，在进行地贫筛查时，需综合分析实验室各项指标联合检测的数据，以降低漏诊率和假阳性率［15］。血常规红细胞参数联合血红蛋白成分分析是目前最为简单、经济的地贫筛查方案，适用于各基层医疗单位；根据筛查结果再进一步行基因诊断则可有效地避免重型地中海贫血患儿出生，极大地提高社会人口质量。

参考文献

［1］Musallam KM，Rivella S，Vichinsky E，et al.Non⁃transfusion⁃dependent thalassemias［J］.Haematologi⁃ca，2013，98（6）：833-844.

［2］李朋，张杰.地中海贫血基因检测方法的研究进展［J］.中国妇幼保健，2016，31（4）：891-894.

［3］Roshan C.Thalassemias：can we reduce the national burden［J］.Mol Cytogenet，2014，7（Suppl 1）：I43.

［4］da Fonseca SF，Amorim T，Purificação A，et al.He⁃moglobin A2values in sickle cell disease patients quan⁃tified by high performance liquid chromatography and the influence of alpha thalassemia［J］.Rev Bras Hema⁃tol Hemoter，2015，37（5）：296-301.

［5］叶智良，赵新，蔡毅瑜，等.MCV、RDW和RBC渗透脆性试验联合检测在珠蛋白生成障碍性贫血筛查中的价值［J］.国际检验医学杂志，2016，37（2）：242-243.

［6］Rachna K，Tejinder S，Nita K，et al.HPLC in Charac⁃terization of hemoglobin profile in thalassemia syn⁃dromes and hemoglobinopathies：a clinicohematologi⁃cal correlation［J］.Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion，2015，31（1）：110-115.

［7］黄金芬.地中海贫血的产前诊断研究进展［J］.中国优生与遗传杂志，2015，23（12）：123-125.

［8］Yin AH，Li B，Luo MY，et al.The prevalence and molecular dpectrum of α⁃and β⁃globin gene mutations in 14，332 families of Guangdong province，China［J］. Plos One，2014，9（2）：e89855.

［9］Lin M，Wen YF，et al.Hemoglobinopathy：molecular epidemiological characteristics and health effects on Hakka people in the Meizhou region，southern China ［J］.Plos One，2013，8（2）：e55024.

［10］李华，何旭霞.广州市黄埔区5306对夫妇孕期地中海贫血的筛查与诊断分析［J］.中国妇产科临床杂志，2016，17（1）：37-39.

［11］刘贵建，孙士鹏.地中海贫血的实验诊断：项目和方法的选择及临床应用评价［J］.中华检验医学杂志，2012，35（5）：385-389.

［12］Bernard G，Forget H，Franklin B.Classification of the disorders of hemoglobin［J］.Cold Spring Harb Per⁃spect Med，2013，3（2）：a011684.

［13］Rachna K，Tejinder S，Nita K，et al.HPLC in charac⁃terization of hemoglobin profile in thalassemia syn⁃dromes and hemoglobinopathies：a clinicohematologi⁃cal correlation［J］.Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion，2015，31（1）：110-115.

［14］陈兴，肖奇志，于雯，等.应用探针熔解曲线分析技术快速检测非缺失型α⁃地中海贫血［J］.国际检验医学杂志，2015，36（14）：2009-2012.

［15］郑琳，黄海龙，范向群，等.血细胞和血红蛋白分析在地中海贫血中的应用价值［J］.中国妇幼保健，2016，31（3）：547-549.

作者单位：深圳市宝安区妇幼保健院中心实验室，广东，深圳518133★通讯作者：肖克林，E⁃mail：lcxkl@163.com

Evaluation of laboratory index for screening thalassemia

CHEN Xi，XIAO Kelin★，LUO Mingyue，MAI Guangxing，XIA Yong
（Central Laboratory，Bao’an Maternal and Child Health Hospital，Shenzhen，Guangdong，China，518133）

［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the value of several laboratory indexes(RBC,HB,HCT,MCV, MCH,MCHC and HbA2)for screening thalassemia.Methods1 373 cases were recruited from Shenzhen Bao’an Maternity and Child Health Hospital,including 548 α⁃thalassemia,248 β⁃thalassemia,33 α⁃and β⁃combined thalassemia and 544 normal,all have been tested for routine blood erythrocyte parameters(red blood cell count,RBC;hemoglobin,HB;hematocrit,HCT;mean corpuscular volume,MCV;mean corpuscular hemo⁃globin,MCH;mean corpuscular hemoglobin concentration,MCHC)and hemoglobin A2(HbA2)quantitative, a⁃and b⁃thalassemia associated genes.The sensitivity,specific,positive predictive value and negative predic⁃tive value of MCV,MCH and HbA2for screening thalassemia were calculated by using gene examination re⁃sults as the golden standard.ResultsIn comparison with normal subjects,RBC,HB,HCT,MCV,MCH and MCHC of thalassemia cases declined(P<0.05),HbA2of β⁃thalassemia increased significantly(P<0.05). The sensitivity and specificity of parallel test of MCV and MCH were 94.0%and 82.9%;The sensitivity and specificity of parallel test of MCV,MCH and HbA2⁃HPLC were 97.7%and 39.2%.ConclusionHbA2quan⁃titaty is a reliable index for screening β⁃thalassemia,but not good for screening α⁃thalassemia because of thelower sensitivity and high misdiagnosis risk.The parallel tests of MCV,MCH and HbA2⁃HPLC were of higher detection sensitivity,but specificity of that was not ideal.So the laboratory indexes of screening thalassemia should be analyzed comprehensively,in order to reduce the rate of misdiagnosis.

［KEY WORDS］Thalassemia;Mean corpuscular volume;Mean corpuscular hemoglobin;Hemoglobin