中国广东地区汉族人群P选择素糖蛋白配体⁃1 Met62Ile基因多态性与冠心病的相关性探讨

明凯华　雷秀霞　邹愉　杨娜　徐邦牢　黄子宜



中国广东地区汉族人群P选择素糖蛋白配体⁃1 Met62Ile基因多态性与冠心病的相关性探讨

明凯华★雷秀霞邹愉杨娜徐邦牢黄子宜

［摘要］目的探讨P选择素糖蛋白配体⁃1（P⁃selectin glycoprotein ligand⁃1，PSGL⁃1）Met62Ile （M62I）基因多态性在中国广东地区汉族人群中的分布特点及其与冠心病（coronary heart disease，CHD）的相关性。方法应用聚合酶链反应⁃限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction restriction⁃fragment length polymorphism，PCR⁃RFLP）分析方法检测200名该地区冠心病患者和200名汉族健康人群PSGL⁃1 M62I基因型，计算并比较各组基因型频率及等位基因频率。结果200名冠心病组中P选择素PSGL⁃1 M62I基因型以Met/Met（M/M）型发生频率最高（73.0%），Met/Ile（M/I）型次之（27.0%），未检测到Ile/Ile（I/I）型；M、I各型等位基因频率分别为86.5%、13.5%，该位点基因多态性分布在男女间无显著性差异（P>0.05）。200名正常对照组中P选择素PSGL⁃1 M62I基因型以M/M型发生频率最高（69.0%），M/I型次之（31.0%）未检测到I/I型；M、I各型等位基因频率分别为84.5%、15.5%，该位点基因多态性分布在男女间无显著性差异（P>0.05）。两组人群间各基因型及等位基因分布无显著性差异（P> 0.05）。结论中国广东地区冠心病患者和健康人群PSGL⁃1 M62I基因多态性在男女之间均无较大的差异。PSGL⁃1 M62I位点可能不是冠心病的易感基因。

［关键词］PSGL⁃1；基因多态性；冠心病；性别

P选择素糖蛋白配体⁃1（P⁃selectin glycoprotein ligand⁃1，PSGL⁃1）作为P选择素的配体被发现的粘附分子，是一种跨膜的糖蛋白，具有同源二聚体的结构，具有广泛的生物学活性，其单体分子量约为120 kD，表达于几乎所有类型的白细胞表面［1］。分子生物学研究证实，PSGL⁃1基因存在多个位点多态性并影响其转录和表达［2］。且PSGL⁃1基因多态性可能与炎症性疾病如冠心病等具有相关性。人类PSGL⁃1基因位于染色体的12q24区域，包含2个外显子［3］。目前国外有一些关于PSGL⁃1基因多态性与疾病的研究报道，主要是M62I与可变数量的串联重复序列（variable num⁃ber tandem repeat，VNTR）等位点与心脑血管疾病的相关研究［4-9］。这些基因多态性的存在可能影响PSGL⁃1基因表达和功能。由于国外的文献均是以欧美洲地区人群为研究对象，而我国仅有VNTR基因多态性与冠心病方面的报道［10］，但结果并无相关性。而M62I位点则无相关报道，这可能由于与该位点多态性在亚洲人群中少见或者与心脑血管疾病相关性不强有关。因此，本文旨在通过探讨我国广东地区汉族人群PSGL⁃1 M62I基因多态性的分布特点及与冠心病（coronary heart disease，CHD）间的相关性，了解我国汉族人群PSGL⁃1 M62I基因多态性的分布情况，分析PSGL⁃1 M62I基因与冠心病间的易感性。

1　材料与方法

1.1主要材料

1.1.1试剂

人白细胞DNA提取试剂为中山大学达安基因股份有限公司产品；Permix Taq试剂为日本Ta⁃kara公司产品；限制性内切酶Rsa I为美国Thermo公司产品；其余试剂均为分析纯。

1.1.2引物设计与合成

参照有关文献［8］设计一对引物，P1：5′⁃CTT⁃GCCAGAAACGGAAGCTCCAGAAGT⁃3′，P2：5′⁃TTCCCCATGTTGGCCAGCTCCGT⁃3′。以上引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.2实验对象

冠心病组：200例，均来自2015年3月至10月广州市第一人民医院心内科病房或冠心病监护病房，病例均符合1979年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）关于缺血性心脏病的命名和诊断标准。男性151例，女性49例，年龄37~83岁，平均年龄（54.7±10.2）岁。正常对照组：200例，随机选取广州市第一人民医院健康体检者作为正常对照组，男性151例，女性49例，年龄32~79岁，平均年龄（42.6±8.5）岁。临床、心电图和实验室检查均正常，排除肝、肾、内分泌和心脑血管疾病。所有研究对象均为自然人群、汉族且无血缘关系。

1.3实验仪器

美国伯乐公司BIO⁃RAD S1000型PCR扩增仪和BIO⁃RAD Power Pac电泳仪；日本TOMY公司KIT⁃MAN高速冷冻离心机；英国UVI凝胶成像系统。

1.3实验方法

1.3.1取材

受检者禁食12 h以上，次晨用EDTA⁃K2抗凝管采肘静脉血，-20℃保存备用。

1.3.2人类基因组白细胞DNA提取

按照人白细胞基因组提取试剂盒（中山大学达安基因股份有限公司）的说明进行。

1.3.3方法

聚合酶链反应⁃限制性片段长度多态性（poly⁃merase chain reaction restriction⁃fragment length polymorphism，PCR⁃RFLP）。

1.3.4PCR扩增条件

参照相关文献［9］进行。反应体系为25 mL，其中含Permix Taq 15 mL，引物P1、P2各20 pmol，模板DNA 2.0 mL，不足体积用灭菌双蒸水补足至25 mL，置PCR仪中进行扩增。反应条件为94℃5 min；再按下列程序循环35次：94℃30 s，61℃30 s，72℃45 s；末次循环后，72℃5 min。

1.3.5扩增产物的限制性酶切

酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳，通过英国UVI凝胶成像系统判断结果。酶切条件见表1。

表1PSGL⁃1M62I酶切条件Table 1　Digestion conditions of PSGL⁃1M62I

1.4统计学方法

所有资料均以SPSS 12.0软件包分析。基因型和等位基因频率采用直接基因计数法计算。研究对象与Hardy⁃Weinberg平衡的符合程度、单个基因型及组间等位基因频率比较采用四格表χ2检验。男女间基因频率比较采用R×C列联表χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1PSGL⁃1 M62I基因型检测结果

冠心病组与正常组中均存在PSGL⁃1 M62I基因多态性：PCR扩增产物片段大小均为174 bp，根据限制性内切酶Rsa I酶切片段的情况，基因型有2种，Met/Met（M/M）型（27 bp一条带），Met/Ile（M/ I）型（27 bp、147 bp 2条带），均未检测到Ile/Ile（I/I）型（147 bp一条带）。见图1。

2.2PSGL⁃1 M62I基因多态性分布情况

在冠心病组各基因型分布中M/M型73.0%，M/I型27.0%，I/I型0；等位基因频率分布为M型86.5%，I型13.5%。男女间基因型、等位基因频率分布存在较大差异（P=0.07），但差异无显著性（P> 0.05）（表2）。

表2 冠心病组男女PSGL⁃1M62I基因型及等位基因分布（%）Table 2　Distribution of CHD group PSGL⁃1M62Ipolymorphism genotype and allele frequencies in male and female（%）

在正常对照组各基因型分布中M/M型69.0%，M/I型31.0%，I/I型0；等位基因频率分布为M型84.5%，I型15.5%。男女间基因型、等位基因频率分布均无显著性差异（P>0.05）（表3）。

2.3组间PSGL⁃1 M62I基因型频率及等位基因携带频率比较

排除年龄和性别影响后两组间PSGL⁃1 M62I多态性相比较，发现PSGL⁃1 M62I基因型分布及等位基因携带频率均无显著差异（P> 0.05）（表4）。

3　讨论

冠心病是由环境和遗传等多种因素共同作用而导致的一类极其复杂的疾病，炎症基因也被认为在冠状动脉粥样硬化形成中起了重要的作用。PSGL⁃1是体内参与炎症反应的重要粘附分子。PSGL⁃1是90年代初期发现的一种作为P⁃选择素的配体的粘附分子，是一种I型跨膜的糖蛋白，选择素及其配体PSGL⁃1可在血流状态下介导白细胞在内皮细胞上的起始粘附，进而引起一系列的级联反应，最终促进了动脉粥样硬化斑块的形成［11］。因此，PSGL⁃1在冠心病发病机制中可能发挥一定的作用。

近些年，国外仅有几篇关于PSGL⁃1 M62I基因多态性与心脑血管方面研究的文献［2，4-5，9］，而国内只有关于PSGL⁃1 M62I基因多态性与脑卒中方面研究［12］，心血管方面则无文献报道。因此，本研究率先分析了中国广东地区200名冠心病患者与200名正常对照人群PSGL⁃1 M62I基因多态性的遗传分布特点，结果显示CHD组和正常对照组各基因型和等位基因频率分布几乎一致，在我们所观察的2组人群中M62I均只表现出2种基因型：M/M型和M/I型，这与国外文献报道相符［2，5，9］。但并未发现I/I型，可能研究的样本量还不够。由此说明同其他国家和地区一样在我国广东地区汉族人群中存在M62I基因多态性，也证明基因多态性是人类基因组中非常普遍的现象。

性别差异在心血管疾病的病理有尚未得到广泛研究［13⁃15］。有证据表明性别特异性影响人类基因表型结构，包括生殖，生理和疾病特征［16-18］。本次研究显示两组人群中CHD PSGL⁃1 M62I基因多态性在男女间差异均无显著性（P>0.05）。另外，本研究发现CHD组中PSGL⁃1 M62I M/M和I/I基因型在男女间存在较大差异（P=0.07），但未有显著性差异，可能与样本量不够大有关。本研究结果与Volcik等［8］文献报道并不相符，这种差别可能是导致冠心病在不同性别及种族间的发病率和临床表现存在显著不同的因素之一。

对M62I位点酶切多态性进行分析显示：CHD 组M/M、M/I基因型构成比分别为73.0%和27.0%，对照组中分别为69.0%和31.0%，PSGL⁃1 M62I位点多态性在两组间的分布无统计学差异（P> 0.05）。说明M62I位点可能不是CHD的易感基因，后期需加大两组间的样本量再进行比较。

另外，本研究结合国外相关文献，将塞尔维亚［8］、德国［4］人群PSGL⁃1 M62I基因多态性研究结果与本研究进行对比分析，我们发现PSGL⁃1 M62I基因型和等位基因频率与西方这些国家人群均分别存在显著差异（P<0.001），M型等位基因频率远远低于以上2个地区人群水平，而I型等位基因频率则高于以上2个地区人群水平，说明M62I基因多态性在不同种族间呈现种族和地域的差异显著。这一结果符合遗传学规律，即亲缘关系越远，其基因型分布越显著。

综上，基因多态性是人类基因组中一个较为常见的现象，而心血管疾病的发生和发展受到多种因素的影响。本文以PSGL⁃1 M62I基因作为研究对象，研究我国汉族人群中PSGL⁃1 M62I基因多态性的分布特点并探讨该位点多态性与CHD的关系，从而为今后进一步研究我国汉族人群中某些疾病的发生发展与PSGL⁃1 M62I基因多态性的关系奠定基础。

表3　正常组男女PSGL⁃1M62I基因型及等位基因分布（%）Table 3　Distribution of normal group PSGL⁃1M62Ipolymorphism genotype and allele frequencies in male and female（%）

表4CHD组与正常组间PSGL⁃1M62I多态性相比较（%）Table 4　Comparison of PSGL⁃1M62Ipolymorphisms between CHD group and normal group（%）

参考文献

［1］Moore KL，Stults NL，Diaz S，et al.Identification of a specific glycoprotein ligand for P⁃selectin（CD62）on myeloid cells［J］.J Cell Biol，1992，118（2）：445-456.

［2］Tregouet DA，Barbaux S，Poirier O，et al.SELPLG gene polymorphisms in relation to plasma SELPLG lev⁃els and coronary artery disease［J］.Ann Hum Genet，2003，67（6）：504-511.

［3］Veldman GM，Bean KM，Cumming DA，et al.Ge⁃nomic organization and chromosomal localization of the gene encoding human P⁃selectin glycoprotein ligand ［J］.J Biol Chem，1995，270（27）：16470-16475.

［4］Schmalbach B，Stepanaow O，Jochens A，et al.Deter⁃minations of platelet⁃lerkocyte aggregation and platelet activation in stroke［J］.Cerebrovascular Diseases，2015，39（3-4）：176-180.

［5］Bugert P，Vosberg M，Entelmann M，et al.Polymor⁃phisms in the P⁃selectin（CD62P）and P⁃selectin glyco⁃protein ligand⁃1（PSGL⁃1）genes and coronary heart disease［J］.Clin Chem Lab Med，2004，42（9）：997-1004.

［6］Rolda´n V，Gonza´lez-Conejero R，Marı´n F，et al. Short alleles of P⁃selectin glycoprotein ligand⁃1protect against premature myocardial infarction［J］.Am Heart J，2004，148（4）：602-605.

［7］Ozben B，Diz⁃Kucukkaya R，Bilge AK，et al.The as⁃sociation of P⁃selectin glycoprotein ligand⁃1 VNTR polymorphisms with coronary stent restenosis［J］.J Thromb Thrombolysis，2007，23（3）：181-187.

［8］Volcik KA，Ballantyne CM，Coresh J，et al.Specific P⁃selectin and P⁃selectin glycoprotein ligand⁃1 geno⁃types/haplotypes are associated with risk of incident CHD and ischemic stroke：the Atherosclerosis Risk in Communities（ARIC） study［J］.Atherosclerosis，2007，195（1）：e76-e82.

［9］Zivković M，Kolaković A，Radak D，et al.The sex⁃ specific association of Met62Ile gene polymorphism in P⁃selectin glycoprotein ligand（PSGL⁃1）with carotid plaque presence：preliminary study［J］.Mol Biol Rep，2012，39（6）：6479-6485.

［10］蒋小仙.P选择素糖蛋白配体-1 VNTR多态性与冠心病的相关性研究［D］.杭州：浙江大学，2007.

［11］Vestweber D，Blanks JE.Mechanisms that regulate the function of the selectins and their ligands［J］.Physiol Rev，1999，79（1）：181-213.

［12］李滔，梅冰.P-选择素P-选择素糖蛋白配体1血液水平及基因多态性与缺血性脑梗死［J］.微循环学杂志，2015，25（4）72-76.

［13］Stankovic´A，Zivkovic´M，Alavantic´D.Angiotensi⁃nI⁃converting enzyme gene polymorphism in a Serbian population：a gender⁃specific association with hyperten⁃sion［J］.Scand J Clin LabInvest，2002，62（6）：469-475.

［14］Petrovic D，Bregar D，Guzic⁃Salobir B，et al.Sex dif⁃ference in the effect of ACE⁃DD genotype on the risk of premature myocardial infarction［J］.Angiology，2004，55（2）：155-158.

［15］Pleskovic A，Vraspir⁃Porenta O，Zorc⁃Pleskovic R，et al.Deficiency of mast cells in coronary artery endarter⁃ectomy of male patients with type 2 diabetes［J］.Car⁃diovasc Diabetol，2011，10：40.

［16］Ober C，Loisel DA，Gilad Y.Sex⁃specific genetic ar⁃chitecture of human disease［J］.Nat Rev Genet，2008，9（12）：911-922.

［17］Liao YC，Lin HF，Guo YC，et al.Sexdifferential ge⁃netic effect of phosphodiesterase 4D（PDE4D）on ca⁃rotid atherosclerosis［J］.BMC Med Genet，2010，11：93.

［18］Wang L，Yanuck D，Beecham A，et al.A candidate gene study revealed sex⁃specific association between the OLR1 gene and carotid plaque［J］.Stroke，2011，42（3）：588-592.

基金项目：广州市卫生医药科技项目（20151A010009）

作者单位：广州市第一人民医院检验科，广东，广州510180★通讯作者：明凯华，E⁃mail：kz⁃1979@163.com

Investigate the relationship between P⁃selectin glycoprotein ligand⁃1M62Igene polymorphism and coronary heart disease in China Guangdong Han Population

MING Kaihua★，LEI Xiuxia，ZOU Yu，YANG Na，XU Banglao，HUANG Ziyi
（Department of Laboratory Medicine Section，Guangzhou First Municipal People’s Hospital，Guangzhou，Guangdong，China，510180）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the different age groups distribution of P⁃selectin glycoprotein ligand⁃1(PSGL⁃1)Met62Ile(M/I)gene polymorphism in the Chinese Han population and the relationship between the polymorphism and coronary heart disease(CHD).MethodsPolymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism(PCR⁃RFLP)analysis was used to detect the genotype and allele frequency of PSGL⁃1 M62I in 200 patients with CHD and then the genotype and allele frequencies were compared to a control population of 200 healthy,Han Chinese.ResultsIn the 200 CHD patients of Guangdong area,the highest frequency of PSGL⁃1 M62I genotype is M/M(73.0%),followed by M/I(27.0%).The I/I genotype was not detected;M,I allele frequencies were 86.5%and 13.5%.These gene polymorphisms had no significant difference between males and females(P>0.05).In the healthy control population,the highest frequency of PSGL⁃1 M62I genotype is M/M(69.0%),followed by M/I(31.0%).The I/I genotype was also not detected.The allele frequencies of M and I were 86.75%and 13.25%.These gene polymorphisms had no significant difference between males and females(P>0.05).There were no significant differences between CHDgroup and normal group(P>0.05).ConclusionBetween the CHD patients and healthy Han Chinese population of the Guangdong area in China,there were no significant differences in PSGL⁃1 M62I gene polymorphism.The PSGL⁃1 M62I gene may not be the susceptibility gene of CHD.

［KEY WORDS］PSGL⁃1;Genetic polymorphism;CHD;Gender