登革病毒治疗性抗体的基础研究进展

尹庆庆　王建宇　　陈强　　周晓红★



•综述•

登革病毒治疗性抗体的基础研究进展

尹庆庆1王建宇1陈强2周晓红1★

［摘要］近年来蚊媒性传染病登革热在全球呈现快速蔓延和上升流行趋势，但目前仍没有特异性的治疗药物和有效疫苗应用于临床。登革病毒（dengue virus，DENV）治疗性抗体的研发面临抗体依赖性增强效应（antibody dependent enhancement，ADE）等方面的阻滞。本文就目前DENV治疗性抗体主要靶向表位及ADE等基础研究进行综述，为治疗性抗体和疫苗深入研究提供参考。

［关键词］登革病毒；治疗性抗体；抗体依赖性增强效应；人源中和抗体；E蛋白二聚体依赖性表位

登革热（dengue fever，DF）是由登革病毒（den⁃gue virus，DENV）引起的一种蚊媒传染性疾病，主要流行于热带和亚热带地区，目前疫情已快速蔓延至100多个国家，全球超出1/3人口正面临感染DENV的风险［1］。平均每年感染DENV的3.9亿人口中近25%出现临床症状［2］，可导致普通DF和重症DF，重症DF患者有严重出血、休克及严重脏器损伤等高危临床表现［3］。2014年登革热在我国尤其在广东/广州大规模暴发流行，疫情以DENVⅠ型为主，Ⅱ型、Ⅲ型散发，重症病例显著增多，其中血小板严重下降、多器官衰竭病例增多，结合近年来Ⅰ~Ⅳ型DENV均在广州出现，再次感染尤其是出现交叉型别感染易增加病毒感染的抗体依赖性增强效应（antibody dependent enhancement，ADE），而登革热目前仍没有特异性治疗药物和有效疫苗，登革热防控形势依然严峻。因而，开展DENV中和性抗体相关研究一直是重要的防治研究方向，为治疗性抗体的进一步研制奠定基础，本文就其国内外基础研究进展进行综述。

1　登革病毒生物学特征

DENV是一种有包膜的单股正链RNA病毒，隶属于黄病毒属，其基因共编码10种蛋白，其中3种结构蛋白（C、M、E蛋白）和7种非结构蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5蛋白）。病毒成熟期间，在furin蛋白酶作用下，前体蛋白（prM）可被切割为pr片段和膜结合蛋白（M），并使病毒颗粒表面的包膜蛋白（E）重排，形成含M蛋白的病毒颗粒。prM释放初期，病毒颗粒开始具感染性，E蛋白结合到细胞受体，介导病毒和细胞膜的融合，致使病毒的RNA进入细胞内［4］。一个成熟的DENV外膜由90个E蛋白二聚体组合形成20面体结构。所有的E蛋白亚单位组成不相同的病毒表面蛋白结构、空间位置以及与其他因素的相互作用，导致E蛋白对受体亚单位和抗体的结合效应的时空动态性。E蛋白单体在中性pH条件下是一种维持亚稳定状态的可溶性蛋白，包括3个结构域：EDⅠ、EDⅡ和EDⅢ。EDⅠ对于稳定E蛋白的氨基端和DⅡ的羧基端环状结构起重要作用；EDⅡ包含疏水融合环（fusion loop，FL），促进弱酸性环境下与内体膜的融合［5］；EDⅢ是DENV与细胞膜受体结合的主要功能区域，EDⅢ空间构象改变或基因突变可能会影响与膜的融合，导致病毒毒力的减弱或致使病毒逃逸于机体的免疫中和效应。

DENV血清型分类是主要由E蛋白决定，分4种不同血清型（DENVⅠ~Ⅳ）。非结构蛋白中特别是NS1蛋白在病毒感染和机体免疫过程中起重要作用。

NS1蛋白是DENV中一种高度保守的糖蛋白。Kyung等［6］报道西尼罗病毒NS1蛋白也存在3个结构域：FR⁃Ⅰ、FR⁃Ⅱ和FR⁃Ⅲ，但具体结构尚未解析。人体血液循环中游离的NS1蛋白已被用来作为DENV感染急性期的血清标本检测指标［7］。

DENV感染宿主的特点有：（1）初次感染某种血清型的DENV后，感染者能产生针对同型DENV长久免疫保护作用［8］；（2）当再次接触异型DENV时，体内抗体与异型病毒会有短暂的交叉反应且特异结合能力弱，由于ADE效应导致感染加重［9］，ADE效应多发于二次感染；（3）对于感染过某种类型DENV孕妇，出生婴儿若感染与母亲同型DENV时，由于婴儿体内抗体浓度较低，亦可能出现严重感染现象；（4）未完全成熟的DENV颗粒开始具有感染性。

2　登革中和性抗体研究现状

目前DENV抗体研究，从抗体来源分鼠源、人源化和人源3种类型，人源化抗体与鼠源抗体相比具有的特点：（1）免疫原性低于鼠源抗体；（2）亲和力弱于鼠源抗体，特异性优于鼠源抗体；（3）人源化抗体Fc段能够诱发机体的效应功能；（4）在体内半衰期长；（5）价格仍较昂贵。人源化抗体仍含有10%~30%的鼠源蛋白，在临床应用时仍存在免疫排斥反应的潜在威胁，因而人源抗体是DENV治疗性抗体的重要研发目标之一。构建全人抗体的方法主要有抗体库技术和转基因小鼠技术。但亦有报道对一些人源化和人源抗体进行序列比较分析，并没有显著性差异；人源化单抗与全人单抗的免疫原性之间的差异亦是微弱的；结合亲和力往往与交叉反应性相关，即与靶位点结合非常强烈的单抗亦可与结构相似非靶蛋白结合，因而，抗体亲和力增强也可导致特异性减弱［10］。

DENV抗体中和性研究是深入研发治疗性抗体的重要基础。抗体中和活性检测方法多样，中和活性检测的金标准是噬菌斑减少中和试验，一种改进的基于酶联免疫斑点技术的微中和试验技术，使中和实验更为便捷［11］。DENV抗体根据其识别特点，分为型特异性抗体和交叉反应性抗体。抗体产生ADE效应的功能大于中和效应，称为增强抗体。人体感染DENV后，产生的DENV抗体中有同时针对3种类型或4种类型的通用型抗体，亦有分别针对单一型别的特异性抗体，且部分抗体存在明确的ADE效应。由于NS1不是病毒颗粒的组成成分，因此认为抗NS1抗体一般不产生ADE效应。DENV中和抗体型别主要是IgG。大量体内、外实验证明：中和抗体能有效阻止DENV的感染，不仅能发挥病毒感染前的预防作用，而且在病毒感染后的一段时期内，依然能发挥治疗病毒感染的作用。

2.1DENV中和抗体主要靶向表位

DENV中和抗体对同型DENV的中和能力随毒株的不同，甚至同种毒株基因型的不同而不同［12］。一般而言，对其诱发毒株的中和能力是最强的。DF流行末期中和抗体水平高于流行初期，轻症DF患者中和抗体水平高于重症患者［13］。理想的DENV治疗性抗体是能同时针对4种血清型的广谱中和抗体，又能避免ADE效应。人体感染DENV后体内可以针对不同的登革抗原表位产生多种单克隆抗体，其中就有多种是中和抗体。特异性的中和抗体大多在初次感染产生，而二次感染和恢复期患者的血清中有交叉反应抗体，同时也存在ADE效应。

目前研究认为，以90个密集的二聚体穿插分布在DENV膜表面的E蛋白是主要抗原，是治疗性抗体和疫苗研发的主要靶标［14］。虽然研究表明单抗可结合到DENV E蛋白的所有3个结构域，但最高效的结合表位位于EDⅢ。EDⅢ存在2部分重叠区域，其旁一根突起的侧脊是与中和抗体高效结合的表位区。DENV抗体研究靶向PrM和NS1亦有报道［15］。C蛋白为补体结合抗原，一般不诱导机体产生中和性抗体。E、PrM和NS1的相关抗体研究因抗原不同的特性而分别靶向中和作用、ADE效应、诊断效能3个不同的领域。目前全球有关中和抗体的研究简况总结见表1。

表1　具有DENV中和作用的单抗基础研究情况一览表Table 1　A list of the recent progress in basic research concerning the therapeutic anti⁃dengue antibodies

*本机构非该抗体的直接研发机构，开展了抗体中和作用等功能研究工作

E蛋白表面预测有180个潜在抗体结合位点［43］，有线性和立体构象型表位，并非均能成为抗体结合的有效表位。E蛋白的3个结构域对应的单抗：抗DEⅠ单抗具有群特异性的，由于空间位阻，抗EDⅡ抗体不具备或仅具备弱的中和作用［44］。EDⅢ参与病毒的感染过程，且该区相对保守，是E蛋白抗体的主要研究区域，抗EDⅢ抗体保护作用主要是阻断DENV与宿主细胞的融合。EDⅢ在3个结构域中免疫原性最强，因而是DENV亚单位疫苗及DNA疫苗及中和抗体系列研究的重要靶标，可诱导中和抗体以及Thl为主的T细胞免疫反应的产生［45］。研究证实交叉保护性鼠源单抗主要识别位于EDⅠ和EDⅡ间的疏水口袋区及EDⅡ顶部的融合肽（FL）［46］，亚群特异性中和单抗识别EDⅢA strand［34］，具血清型特异性保护作用的抗体结合主要位于EDⅢ蛋白A链和侧面的脊上重叠并且相邻的表位［31-42］。

不同血清型对应EDⅢ区中和抗体结合表位不同，多项研究发现，含有单一血清型特异性（type⁃specific，TS）表位、针对2~3种血清型的亚复合体反应（sub⁃complex reaction，sCR）表位以及同时针对4种血清型的复合体反应（complex reaction，CR）表位，多株鼠源单克隆抗体也分别定位到这些表位。大多数抗DENVⅠ~ⅡEDⅡ鼠源中和性单抗表位集中E蛋白的A链和/或侧脊表位。有研究表明几个能产生免疫反应的弱中和性交叉反应抗体（5A2⁃7，13D4⁃1和E111）结合的氨基酸残基是在EDⅢAB loop［34］。Rajamanonmani等［31］发现由DENV⁃2 rEDⅢ免疫小鼠制备中和4种血清型的高效中和性抗体9F12的识别表位为A⁃strand和BC⁃loop，9F12单抗主要是在病毒感染早期起预防保护作用，其具广泛交叉中和病毒的能力，进行优化和人源化后可作为治疗严重登革病例的候选治疗性抗体。

李孝权等［47⁃48］检测107株E蛋白单抗中的94株具有抗EDⅢ中和活性，通过酶联免疫吸附试验等筛选的单抗有42株为TS单抗、26株为sCR单抗及23株针为CR单抗，另有3株黄病毒交叉反应单抗。其中CR单抗大都特异性识别相同序列aa310⁃319，各血清型间在该位点高度保守且是免疫优势的复合体表位，进一步发现AB loop上的Q316、H317是该表位的关键残基，但该位点单抗中和活性较弱。对鼠源抗EDⅢCR抗体靶位点的深入探究，发现15株能特异识别DENV⁃1 ED Ⅲaa309⁃320，但中和活性较弱，推测AB loop并不是一个良好的亚单位疫苗候选表位。2B11A35和2D73A7则是2株能强力中和DENV 4种血清型的单抗。单抗2B11A35结合表位的关键氨基酸残基在EDⅢ蛋白AB loop、D strand区（315、316、317、318、356、368 aa）和EF loop、G strand区（372、374、391 aa）这2个区域附近，不与AB loop的线性多肽309~310 aa反应，因此推断2B11A35所识别表位的关键位点应该在EF loop附近，同时跨越G strand部分区域；2D73A7所识别表位的关键氨基酸残基也应该在EF loop附近，同时跨越CC'loop，而单抗2D73A7的表位暴露性优于单抗2B11A35的表位。因而认为抗EDⅢ蛋白的交叉保护性中和抗体识别位于EF loop附近区域［37］。

目前全球报道的DENV中和抗体表位多与DENV E蛋白有关，Dejnirattisai等［36］2015年报道自DF患者血清分离获得一类具有针对4种型别DENV的广泛强中和效应的人源抗体，经X⁃射线晶体结构分析，揭示这些抗体与DENV E蛋白二聚体形成复合物，二者识别的决定性因素为E蛋白二聚体界面的DENV血清型别恒定区位，包括E蛋白的融合环主链和2个保守的糖链，识别表位为E蛋白二聚体依赖性表位（E⁃dimer⁃dependent epit⁃ope，EDE）。该广谱中和抗体结合靶位点位于E蛋白2个保守的糖基化位点N67和N153，具有很强的中和能力，即使在低浓度下也有50%的中和率，并与抗FL中和抗体中和能力进行对比，发现该抗EDE抗体不能中和完全未成熟的DENV，但中和完全成熟和部分成熟DENV能力相当。在未成熟颗粒中，覆盖在E蛋白FL上的prM与E蛋白的结合较弱，这就有利于抗FLE有效取代prM而与FL结合，这点在成熟微粒中就没那么明显，反而结合力有所减弱。且该抗EDE单抗ADE效应显著低于抗FLE单抗产生的ADE效应，具90%的中和效价。

从上述有关E蛋白中和抗体基础研究情况可以看到：（1）针对DENV EDⅡ：FL loop对应的交叉中和性抗体（E53）大都中和效率低且易产生ADE效应；针对BC loop的交叉中和抗体（1C19）不仅能高效中和DENV且还能与低效抗FL抗体竞争结合。（2）针对DENV EDⅢ：AB loop对应交叉中和抗体一般具弱中和性，EF loop附近形成的单抗（2B11A35/2D73A7）具高效交叉中和能力，A strand表位（单抗，DB32⁃6）具有高效中和活性；（3）针对EDE：单抗（EDE1/EDE2）是一类新型高效广谱的人源中和抗体。

由于NS1蛋白不属于病毒颗粒蛋白，体内产生的抗NS1抗体并不能直接与病毒接触，具体机制还有待研究。目前国内外研究中，有诸多关于NS1蛋白的免疫原性及制备单抗研究，并应用于临床DF的急性期诊断。

2.2DENV抗体与ADE

李孝权等［47］建立了通过抗原捕获定量检测培养上清中抗原ADE的检测方法。DENV的ADE效应，目前研究表明主要发生在二次感染，抗体产生ADE的主要原因是抗体的交叉弱中和性，抗prM抗体是引起ADE的关键。在自然条件下，原发感染DENV，人体产生抗体中大部分具交叉弱中和性，仅有一小部分是型特异性高效中和抗体［42，49-50］。交叉反应型抗PrM抗体在初次感染就有出现，二次感染患者体内的prM抗体水平显著升高。对于DENV，M蛋白开始出现时病毒始具感染性。无感染性的DENV在抗PrM抗体的作用下，也变得有感染力，抗prM抗体产生ADE不仅因为抗体的交叉性，还与PrM在病毒表面的存在有关。Dejnirattisai等［51］通过对抗NS1抗体、E抗体和prM抗体进行比较分析发现，只有抗prM抗体在抗体低浓度和高浓度时均促进ADE发生，而在DENV各血清型中均有很强的交叉反应，但即使在高浓度下也无法中和感染。推测病毒表面prM的部分裂解可减少病毒表面可中和病毒抗体的抗原密度，使DENV在存在抗prM抗体时更容易产生ADE。ADE不仅促进未成熟颗粒与FcγII受体结合使病毒进入细胞，而且增强病毒于细胞内的复制，调节细胞内抗病毒机制［52］。靶细胞内Furin蛋白酶的活性对内化的未成熟的登革病毒感染性至关重要，这些现象说明未成熟登革病毒存在潜在的高感染性和可能增强疾病的发生［53］。

有研究表明，型特异性抗体高浓度时在体外和动物模型内有很强的中和能力，而低浓度时也可能会增强病毒感染；一般情况下，交叉反应抗体中和能力较弱且能在一定条件下增强病毒感染表达Fc受体的细胞［49］。因此，找到一个具交叉反应且高效中和能力抗体的保守位点很有必要。如高效交叉中和抗体（1C19）识别的保守位点（BC loop），能竞争抑制低效抗FL单抗的结合，这种特性可能可以用来拮抗、避免ADE［41］。

为了避免ADE效应，有学者［39］通过基因工程技术构建具有广谱中和活性的双可变区抗体DVD1A1D⁃1G6并对介导ADE效应的Fc段缺失突变，该双可变区抗体是将具有一定体内治疗作用的鼠源特异性抗DV⁃4 EDⅢ抗体1G6的可变轻重链序列、DV1⁃3抗体1A1D⁃2［19］的轻重链可变区序列与人重链（Ig G1）和轻链（κ）恒定区连接构成全长人⁃鼠嵌合抗体。对黄病毒属的西尼罗病毒的研究中发现，在C1q和FcγR敲除小鼠中，抗体的体内保护活性不受影响，可能是由于抗体的中和能力发挥了比抗体后续效应功能重要得多的功能。通过抗体改造如进行Fc糖基化改造等也可在一定程度降低或消除ADE效应，但同时也会降低细胞的ADCC效应。对于PrM产生的ADE，进一步找到抗PrM抗体的ADE相关表位，亦是重要的研究方向。

3　结语

综上所述，DENV抗体基础研究历时几十年，已取得系列重要进展。DENV的E蛋白及其抗体的结构以及相互作用分子机制的解析，已逐步清晰定位中和抗体的作用靶位点，2015年报道的针对EDE的高效广谱人源中和抗体，给深入的DENV治疗性抗体研发提供了更为明晰的思路。有关抗PrM单抗激发ADE效应的系列研究以及后续需要重点关注的ADE靶向表位的相关研究，相信会进一步推进DENV治疗性抗体的深入研发，而目前DENV治疗性抗体展现的包含ADE在内的多重复杂的分子交互作用机制，以及与人体细胞免疫等出现的协同作用，仍需要深入研究。

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［50］Smith SA，de Alwis AR，Kose N，et al.Isolation of dengue virus⁃specific memory B cells with live virus antigen from human subjects following natural infec⁃tion reveals the presence of diverse novel functional groups of antibody clones［J］.J Virol，2014，88（21）：12233-12241.

［51］Dejnirattisai W，Jumnainsong A，Onsirisakul N，et al. Cross⁃reacting antibodies enhance dengue virus infec⁃tion in humans［J］.Science，2010，328（5979）：745-748.

［52］Chareonsirisuthigul T，Kalayanarooj S，Ubol S.Den⁃gue virus（DENV）antibody⁃dependent enhancement of infection upregulates the production of anti⁃inflam⁃matory cytokines，but suppresses anti⁃DENV free radi⁃cal and pro⁃inflammatory cytokine production，in THP⁃1 cells［J］.J Gen Virol，2007，88（2）：365-375.

［53］Rodenhuis⁃Zybert IA，van der Schaar HM，da Silva Voorham JM，et al.Immature dengue virus：a veiled pathogen？［J］.Plos Pathog，2010，6（1）：e1000718.

2.亚利桑那州立大学生物设计研究所和生命科学学院，亚利桑那州，坦佩AZ 85281

★通讯作者：周晓红，E⁃mail：daizhouxh@163.com

基金项目：国家留学基金（留金发【2010】3009号）；广州市对外科技合作专项（2012J5100026）；南方医科大学交叉学科创新团队培育计划（B1012086）

作者单位：1.南方医科大学公共卫生与热带医学学院病原生物学系暨广东普通高校新发传染病防治重点实验室，广东，广州510515

Recent progress in basic research concerning the therapeutic anti⁃dengue antibodies

YIN Qingqing1，WANG Jianyu1，CHEN Qiang2，ZHOU Xiaohong1★
(1.Key Laboratory of Prevention and Control for Emerging Infectious Diseases of Guangdong Higher Institutes,Department of Pathogen Biology,School of Public Health and Tropical Medicine,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong,China,510515;2.Biodesign Institute and School of Life Science,Arizona State University,Tempe,Arizona,USA,AZ 85281)

［ABSTRACT］Recently,dengue fever,the mosquito⁃borne infectious disease,spread rapidly all around the world.However,there is neither specific medicine nor effective vaccine which can be used in clinic.The studies concerning therapeutic⁃antibodies against dengue virus(DENV)are facing major blocks of antibody⁃dependent enhancement(ADE),etc.This review highlights the current basic research to figure out the targeted epitope of therapeutic⁃antibodies against dengue virus and the molecular mechanism involving in ADE.This paper will provide valuable insight for the further studies of dengue fever.

［KEY WORDS］Dengue virus;Therapeutic antibody;Antibody⁃dependent enhancement;Human⁃derived neutralizing antibody;E⁃dimer⁃dependent epitope