游离金雀异黄素和大豆苷元大鼠尿液排泄动力学研究

邹慧琴　刘亚兰　　余梦杰　王海鹏　　王毓　　谢宝刚　张守华



游离金雀异黄素和大豆苷元大鼠尿液排泄动力学研究

邹慧琴1刘亚兰1余梦杰1王海鹏1王毓1谢宝刚1张守华2★

［摘要］目的建立大鼠尿液中游离金雀异黄素（genistein，GT）和大豆苷元（daidzein，DD）同时定量的分析方法，获得其口服后大鼠尿液排泄动力学参数，为大豆异黄酮生物利用度研究和评价提供新的方法。方法大鼠单次灌胃给予GT和DD混悬液（15.0 mg/kg），在给药后不同时间段收集尿液，尿液经冷冻干燥后，加1.0 mL甲醇溶解提取目标化合物。采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定游离GT和大DD的浓度，采用Krommasil C18色谱柱，以甲醇⁃水（52∶48）为流动相，流速1.0 mL/min柱温为30℃，检测波长254 nm。结果建立的高效液相色谱法⁃紫外法（HPLC⁃UV）方法专属性强，在0.5~10.0 μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系，良好的精密度及较高的准确度。尿液排泄动力学曲线图上第4.5 h和13.5 h别显示小肠和肝肠循环2个吸收峰，游离GT和DD清除半衰期分别为（7.5±0.59）h和（8.5±1.2）h，72 h尿液累积量分别为（45.2±7.2）μg和（56.1±12.2）μg。结论所建立的方法可靠，简便快速，可用于比较和评价大豆异黄酮类制剂的口服吸收生物利用度和代谢动力学研究。

［关键词］游离金雀异黄素和大豆苷元；高效液相色谱；尿液排泄动力学；生物利用度

大豆异黄酮是一种重要的植物雌激素，它能通过与雌激素受体（estrogen receptor，ER）竞争性地结合从而干扰雌激素功能，发挥其生物学作用［1-2］。金雀异黄素（genistein，GT）和大豆苷元（daidzein，DD）是大豆异黄酮的主要活性成分，具有轻度雌激素样作用，无明显副作用，是一种安全的天然植物雌激素。近年来，许多研究表明，这2种化合物具有抗氧化、抗癌、预防骨质疏松症、预防心血管疾病、改善妇女更年期障碍、抗衰老等诸多生理功能［3⁃6］。欧洲一个大型流行病学调查发现，在男性血液中，拥有更高浓度GT的人患前列腺癌的几率更小［7］。目前国外各种大豆异黄酮的医药制品和保健食品正在积极开发，并已有相关品种上市销售。

在体内，GT和DD发挥其雌激素样功能的物质基础可能其游离形式［8⁃9］，然而，血液中GT和DD主要以他们的代谢物如葡萄糖醛酸及硫酸酯代谢物存在，其游离形式不足总量的5%［1，10］。因此，以血液为样品的药代动力学研究大多是测定血中总的GT和DD含量。迄今为止，国内外关于GT和（或）DD在大鼠或人体内药代动力学研究较多，但关注体内游离GT和DD排泄动力学方面的研究很少。鉴于此，本文建立样品预处理简单、重复性好的对大鼠尿液中游离GT和DD进行同时定量的HPLC⁃UV分析方法，在此基础上，获得大鼠口服GT和DD后的尿液排泄动力学参数，为大豆异黄酮各种制剂口服吸收生物利用度研究和评价提供新的方法。

1　材料与方法

1.1仪器与试药

高效液相色谱仪（岛津10A⁃VP系统，配备双波长紫外检测器，日本岛津公司）；冷冻干燥机（LGD⁃10D，北京四环科学仪器厂）；CQ⁃250型超声波清洗仪（上海中船七院七二六所）；Sartorious BP211D型十万分之一电子天平（德国沙多利斯公司）。GT和DD购自上海融禾生物科技发展有限公司（纯度大于98%，GT和DD批号分别为：20140708和20140904）；另取大约5 g GT和DD 80℃真空干燥至恒重后作为对照品使用。色谱纯甲醇（上海陆都有机化学试剂有限公司），水为自制三重蒸馏水。

1.2实验动物

Sprague⁃Dawley（SD）大鼠由南昌大学实验动物中心提供，合格证书：医动字第021⁃9602号，不含大豆成分饲料喂养，实验过程自由进食和水。

1.3HPLC色谱分析条件

采用Krommasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，迪马科技有限公司）色谱柱。以甲醇⁃水（52：48，v/v）为流动相，等度洗脱。流速1.0 mL/min，柱温为30℃，进样20 μL，检测波长254 nm。

1.4给药方案

8只SD大鼠，体重(200±20)g，不锈钢代谢笼单独饲养，每天光照12 h，室温（22~24℃），室内相对湿度30%~70%。适应喂养3 d后，第4天上随机收集2只大鼠21：00~9：00夜间12 h尿液，作为空白尿样。上述收集尿样马上于5 000 rpm离心10 min 于-20℃冷冻保存。分别称取GT和DD约50.0 mg，用0.2%CMC⁃Na溶液配制浓度为3.0 mg/mL的混悬溶液，第5天大鼠灌胃给药，第3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h后分别收集其尿液，5 000 rpm离心，取上清置于-20℃冰箱备用。

1.5尿液样品的处理

所收集的尿液样品自然解冻后，间隔3 h样品（大约2~4 mL）全部用来冷冻干燥；间隔12 h样品由于量较大，准确测定体积后取4.0 mL进行冷冻干燥。冻干粉末每管加1.0 mL甲醇，漩涡振荡、超声约2 min，于10℃14 000 rpm离心10 min，取0.5 mL 于1.5 mL离心管中，再加0.5 mL蒸馏水，HPLC进样20 μL测定游离GT和DD的含量。

1.6对照品溶液的配制

一定浓度的GT和DD对照品溶液用水稀释使其终浓度为100.0 μg/mL和102.5 μg/mL的工作液。分别取5、10、20、40、80、100 μL到不同的EP管中，编号。各管分别加入3.0 mL空白尿液，冻干，按样品处理方法同样提取后分别进样色谱分析，以目标色谱峰面积与标准品浓度作图，得到尿样工作曲线。

2　结果

2.1色谱条件的优化和方法的专属性

本实验色谱分离条件的优化主要考察流动相的组成和检测波长2个因素对样品分离效果的影响。考察了3个pH值（2.5，4.0，6.0）的10 mM乙酸铵溶液以及蒸馏水作为水相，甲醇或乙腈作为有机相的流动相对尿样提取物中GT和DD分离。结果表明实验的几种流动相对2种化合物均能达到基线分离，且色谱峰型对称。考虑到实验成本和流动相配制的方便，本实验选用甲醇⁃水溶液为流动相。鉴于尿样提取物样品较为复杂，8 min前有一定的干扰，流动相定为52%的甲醇，此时2种化合物出峰时间在8.5 min和12.0 min左右。鉴于GT和DD的最大吸收波长分别为260 nm和248 nm，考虑到需同时在尿液中检测GT和DD，故选择检测波长为254 nm定量，以获得较高的检测灵敏度。

分别取空白尿液、空白尿液加入GT和DD对照品，以及大鼠给予GT和DD后所收集尿液，按建立的尿样处理方法和HPLC方法操作和进样，所得的色谱图见图1。从图上可看出，在建立的HPLC条件下及样品提取处理条件下，样品中的内源性成分及检测物质代谢物等对目标成分的含量测定没有干扰，说明该方法具有良好的专属性。

2.2工作曲线的建立

按照上述尿液样品处理方法，配制含有GT和DD系列浓度的尿液对照品溶液，分别进行HPLC分析。以GT和DD的峰面积对应其浓度进行线性回归，得到对尿液样品中GT和DD定量的工作曲线。GT和DD的回归方程分别为：A=91 344C+9 168.2和A= 76 402C+16 879（其中A为峰面积，C为浓度），2种化合物在0.5~10.0μg/mL浓度范围内的线性相关系数均大于0.99，表明他们的浓度和色谱峰面积信号具有良好的相关性，满足定量的要求。根据色谱信号信噪比大于3∶1的最低浓度为检测限，10∶1为定量限的方法计算。逐步稀释标准品溶液，结果显示GT和DD 2种化合物的检测限分别为0.014 μg/mL和0.030 μg/mL，定量限分别为0.06μg/mL和0.07μg/mL。

2.3精密度

分别以空白尿液加终浓度为10.4 μg/mL的GT 和12.2 μg/mL的DD对照品溶液在同一天（及第2天）重复进样5次，计算相关色谱峰的峰面积标准偏差表示日内（日间）精密度。GT精密度为日内2.12%，日间精密度为2.74%。DD日内精密度为1.88%，日间精密度为3.3%。

2.4稳定性

从以上日间精密度实验数据可以看出，2种化合物在24 h内浓度变化相对标准偏差（relative stan⁃dard deviation，R.S.D.）。小于5.0%，说明样品比较稳定。上述样品4℃放置一个月后按同样方法测定，以原来的标准溶液（4℃保存）建立新的工作曲线，计算其浓度分别为9.9 μg/mL和11.6 μg/mL，变化R.S.D.仍小于5.0%，表明实验样品具有良好的短和长期稳定性。

2.5样品提取回收率及方法加样回收率

把含19.6 μg/mL的GT和20.4 μg/mL的DD对照品溶液尿液冻干粉用甲醇一次提取后，不溶物离心，沉淀再用0.5 mL甲醇溶解，溶解物进行HPLC分析，此时检测不到目标化合物的存在，说明加入1.0 mL甲醇一次提取就可以基本完全提取目标化合物。

按上述建立的方法，分别测定已知GT和DD含量的样品，得到色谱图，以及该样品加一定量对照品（1.0 μg/mL、3.0 μg/mL、6.0 μg/mL 3个浓度）的色谱图，以工作曲线计算相应的浓度，得到加样回收率的数据。GT和DD样品加样回收率分别分别（100.6±5.8）%（n=3）和（102.6±4.5）%（n=3）。

综合以上实验结果可知，应用HPLC⁃UV方法在尿样中同时定量GT和DD专属性强，在一定的浓度范围内具有良好的线性关系，良好的精密度及较高的准确度。

2.6尿液游离GT和DD排泄动力学

图2是单位时间药物排泄量（Du/dt）对时间作图，从该图明显可以看出，GT和DD在给药后4.5 h、13.5 h 2个时间点出现一大一小2个吸收峰。异黄酮药代动力学实验表明在给药后2 h及7 h左右，血液中出现2个吸收峰［10］，分别代表小肠和肝肠循环吸收。由于肾排泄的滞后性，因此在排泄动力学曲线图上给药后第4.5 h（3~6 h中点）、13.5 h（12~15 h中点）2个时间点出现2个峰，表明用尿液排泄动力学方法与血液药代动力学方法具有很好的相关性。

本实验以单位时间药物排泄量（LogDu/dt）与时间作图，对消除相线性回归，求得直线斜率K，以T1/2＝0.693/K计算GT和大豆苷元在体内的消除半衰期，相应的尿液排泄动力学参数列于表1。尿液72小时累积游离GT和DD分别为（45.2±7.2）μg和（56.1±12.2）μg。

表1　口服金雀异黄素和大豆苷元尿样排泄动力学参数（mean±S.E.，n=6⁃8）Table 1　The urinary pharmacokinetic parameters of genistein and daidzein after their oral administration（mean±S.E.，n=6⁃8）

3　讨论

GT和DD体内外检测方法文献报道较多，经过萃取、酸化等前处理过程，Uifălean等［11］以0.1%乙酸和乙腈为流动性，利用HPLC⁃UV方法同时检测了大豆保健品中GT、DD和大豆黄素，线性范围为5.0~80 μg/mL。Magiera［12］以0.05%三氟醋酸和乙腈为流动相，利用超高效液相色谱UHPLC⁃UV技术同时在中草药保健品中同时检测了GT、DD及其他14种化合物。GT和DD检测限为0.05 μg/ mL。本文利用冷冻干燥的方法先处理尿液样品，然后直接用甲醇提取，这样可以保证有效提取GT 和DD的基础上消除尿液中蛋白的影响，样品用水适当稀释后直接进样；另外HPLC⁃UV方分离GT 和DD等化合物，文献大多采用较为复杂的流动相，流动相中如果含有三氟醋酸、三乙胺等化合物在HPLC过程中可能影响基线的稳定、提高方法的检测限。而对于生物样品的分析来说，降低方法的检测限是非常有必要的，本实验结果表明，直接用水和乙腈体系就能很好的在尿液样品中分离这2种代谢物，该方法对GT和DD 2种化合物的检测限分别为0.014 μg/mL和0.030 μg/mL。当然，提高方法灵敏度的另外一种方法就是采用质谱检测器，如经酶解、固相萃取等前处理过程，利用HPLC⁃MS技术［13］，包括GT和DD在内的13种植物雌激素可以同时在人体血液和尿液中定量，尿中GT和DD检测限小于1.0 ng/mL，具于MS的检测技术需要贵重的仪器，样品前处理复杂，分析成本高等缺点。经方法学确证，本文建立的在尿样中同时定量GT和DD的HPLC⁃UV方法，样品前处理简单、专属性强、检测限彽，在0.5~10.0 μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系，良好的精密度及较高的准确度，适应于含GT和DD制剂大鼠的排泄动力学研究。

人体口服大豆异黄酮后，血液中主要是GT和DD的葡萄糖醛酸及硫酸酯代谢物，其游离形式不足总量的5%［1，10］，含量极低，一般低于HPLC⁃UV方法的检测限。因此，以血液为样品的药代动力学研究大部分得先酶解，然后测定血中总的GT和DD含量，获得GT和DD的药动学参数。然而，许多实验结果［8，9，14］表明，GT和DD在体内发挥其雌激素样功能的物质基础是其游离形式，因此获得游离GT和DD的药动学参数可能更有利于不同制剂的评价。鉴于GT和DD为小分子化合物，且主要由肾脏排泄，其尿中的含量与体内血中的浓度具有一定的相关性［5］，因此本文建立了游离GT和DD在大鼠尿液中的HPLC⁃UV检测方法，并获得他们的排泄动力学参数。本文结果显示，口服GT和DD尿液清除半衰期为8 h左右，大鼠单次给予GT和DD后尿样中游离GT和DD的变化满足单室一级排泄动力学模型，与文献报道结果一致［10，14］。本实验结果显示单次口服给予大鼠GT 和DD混悬剂（15.0 mg/kg），其尿液72 h累积游离GT和DD分别为（45.2±7.2）μg和（56.1±12.2）μg。由于尿液累积排泄总量与血浆药物浓度—时间曲线下面积（AUC）成正相关，因此可用尿液中累积异黄酮量评价不同的异黄酮制剂的生物利用度。

总之，异黄酮的口服吸收生物利用度与其预防和治疗疾病的药理作用作用密切相关，到目前为止，以尿液为样品的游离GT和DD排泄动力学研究的报道很少。因此，本文建立了操作简单、重复性好的对大鼠尿液中游离GT和DD进行同时定量的HPLC⁃UV分析方法，实验结果表明该方法专属性强，在一定的浓度范围内具有良好的线性关系，良好的精密度及较高的准确度。本文研究结果显示基于尿液排泄动力学的分析方法可用于比较和评价大豆异黄酮类制剂的口服吸收生物利用度；亦可用于大豆异黄酮在中国居民的体内代谢动力学研究，为进行慢性病治疗、预防提供直接的理论数据。

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2.江西省儿童医院普外科，江西，南昌330006★通讯作者：张守华，E⁃mail：zshouhua416@163.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81560631）

作者单位：1.南昌大学药学院，江西，南昌330006

Investigation of urinary pharmacokinetics of free genistein and daidzein in rats

ZOU Huiqin1，LIU Yalan1，YU Mengjie1，WANG Haipeng1，WANG Yu1，XIE Baogang1，ZHANG Shouhua2★
（1.School of Pharmaceutical Science，Nanchang University，Nanchang，Jiangxi，China，330006；2.Department of General Surgery，Jiangxi Children’s Hospital，Nanchang，Jiangxi，China，330006）

［ABSTRACT］ObjectiveTo offer an alternative approach to evaluate the bioavailability of isoflavone by urinary excretion,establishing an HPLC method for the determination of free genistein and daidzein in rat urine and obtaining the parameters of urinary pharmacokinetics after their oral administration.MethodThe rats were orally administered with a single dose of genistein and daidzein（15 mg/kg）.Urine samples were collected from different time periods.The samples were lyophilized and then extracted ultrasonically by 1.0 mL methanol.HPLC analysis was performed by a reversed⁃phase HPLC column(Kromasil 100A,C18).The elution conditions for HPLC were methanol and water at the ratio of 52%（v/v）for isocratic elution,the column was maintained at 40℃,flow rate was 1.0 mL/min,and detection was set to 254.0 nm.ResultsAn excellent liner relationship was obtained by developed HPLC⁃UV method in the range of 0.5~10.0 μg/mL with high specificity, good precision and high accuracy.A plot of urinary isoflavone concentration versus time suggests that there were two peaks at 4.5 h and 13.5 h related to absorption in intestine and enterohepatic circulation.The half⁃time in urine was found to be(7.5±0.59)h and(8.5±1.2)h for genistein and daidzein respectively.The cumulative excretions of genistein and daidzein for 72 h were(45.2±7.2)μg and(56.1±12.2)μg,respectively.ConclusionThe method is reliable,simple,rapid and suitable for comparison and evaluation of oral bioavailability of isoflavone pharmaceutics as well as pharmacokinetic study.

［KEY WORDS］Free geinistein and daidzein;High performance liquid chromatography(HPLC); Urinary pharmacokinetics;Oral bioavailability