利用融合PCR技术和T载体克隆技术构建结核分枝杆菌PhoPR双组份系统缺失突变载体

王　君，吴　芳，柳小玲，梁　粟，张培培，章　乐，吴江东，曹旭东，张万江



利用融合PCR技术和T载体克隆技术构建结核分枝杆菌PhoPR双组份系统缺失突变载体

王君，吴芳，柳小玲，梁粟，张培培，章乐，吴江东，曹旭东，张万江

石河子大学医学院病原微生物与免疫学教研室/石河子大学《新疆地方与民族高发病》教育部重点实验室/《西部地区高发人兽共患传染性疾病防治》协同创新中心，石河子832002

摘要：目的基于融合PCR技术(SOE-PCR)、T载体克隆技术，构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)双组份系统缺失突变载体的方法。方法利用SOE-PCR技术，将PhoP、PhoR和PhoPR基因上、下游的同源臂与卡那霉素抗性基因融合，构建PhoP、PhoR和PhoPR突变片段，然后将突变片段直接与T载体连接，将其转入E. coli DH5α感受态细胞并筛选抗性克隆，进而获得MTB PhoP、PhoR和PhoPR缺失突变载体。结果成功构建MTB PhoPR双组份系统缺失突变载体，与传统方法相比，效率高、周期短。结论基于融合PCR技术和T载体克隆技术成功构建MTB PhoPR双组份系统缺失突变载体，为下一步构建MTB突变株以及相关研究奠定基础。

关键词：结核分枝杆菌；PhoPR双组份系统；缺失突变株；构建

Supported by the National Natural Science Foundation (Nos. 81260261 and 81160192) and the High-Level Personnel Scientific Research Projects of Shihezi University (No. RCZX201446)

结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的一种古老的、世界性的传染性疾病，也是一种人兽共患传染病。耐药以及耐多药的结核分枝杆菌在我国地区广泛流行，这使得我国的结核病疫情不断加重。然而，MTB的耐药机制并未明确，这也就成为了重点、热点的研究领域。随着研究的不断深入，若要探究某个基因在菌株中的未知作用，首先需要获得该基因失活或缺失的突变株，其次是构建带有该基因片段的载体，并通过一定技术将载体转入已有的突变株中，以便得到重组株。通过对比分析突变株、重组株和野生株之间表型、蛋白等方面的改变，从而发现该基因自身作用以及其在菌株的致病或耐药等方面的作用。故而，成功构建突变株对病原菌各个方面方面的研究尤为重要。

MTB PhoPR双组份系统不仅是12个结核分枝杆菌双组份系统之一，而且是最基本、最重要的的双组分系统。它能够感受外界微环境的改变，并及时调控自身各系统，包括RD1区域基因的表达水平、ESAT-6的分泌等[1-2]，从而调控结核分枝杆菌脂质代谢[3]等方面，使得其在宿主体内得以生存[4-6]。为进一步研究MTB PhoPR双组份系统的功能，本研究以该系统的PhoP基因、PhoR基因和PhoPR基因为目的基因，利用SOE-PCR技术、T载体技术构建MTB PhoPR双组份系统的一系列相关基因缺失突变载体并鉴定，从而证明该方法的可行性与高效性，同时为进一步研究MTB PhoPR双组份系统的功能奠定基础。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株和质粒结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株由中国食品药品检定研究院提供，由本实验室保存；大肠杆菌(E.coliDH5α)由本实验室保存；pMD 19-T Vector购于TaKaRa公司。

1.1.2主要试剂DNA凝胶回收试剂盒、质粒小提取试剂盒、Pfu PCR MasterMix、Taq PCR MasterMix购于天根生化科技(北京)有限公司。其余试剂为进口或国产分析纯。

1.1.3引物从GenBank下载H37Rv菌株PhoP基因、PhoR基因序列及其上、下游同源臂序列，使用primer premier 5.0软件自行设计引物(表1)，并送至上海生工生物工程公司合成。

表1　PhoP、PhoR和Kan相关的引物序列

1.2方法

1.2.1MTB H37Rv菌株全基因组DNA的提取首先将MTB H37Rv菌株接种于改良罗氏培养基，37℃静置培养3～4周，提取菌株全基因组DNA，同时行DNA凝胶电泳及紫外分光光度计分析DNA浓度及纯度[7]。

1.2.2PhoP基因和PhoR基因缺失突变片段的扩增及鉴定以提取的H37Rv菌株全基因组DNA为模板，使用引物PhoP-N-F与PhoP-N-R扩增PhoP基因的N端同源臂，使用引物PhoP-C-F与PhoP-C-R扩增PhoP基因的C端同源臂，得到片段以DNA凝胶电泳鉴定成功后，分别命名为PhoP-N和PhoP-C；以此方法使用各自引物扩增得到PhoR-N和PhoR-C。以pUC19K质粒DNA为模板，使用引物Kan-F和Kan-R扩增卡那霉素抗性基因，得到的片段命名为Kan。将上述各PCR产物分别切胶回收纯化，于-20 ℃保存备用。

1.2.3PhoP、PhoR和PhoPR缺失突变片段的SOE-PCR合成及鉴定通过N端、C端同源臂片段和卡那霉素抗性基因片段融合构建基因突变片段。分别将PhoP-N、Kan、PhoP-C和PhoR-N、Kan、PhoR-C以及PhoP-N、Kan、PhoR-C按照1∶2∶1混合作为SOE-PCR反应的模板，在未加入引物的情况下进行首轮PCR循环反应之后，分别加入PhoP-N-F、PhoP-C-R和PhoR-N-F、PhoR-C-R和PhoP-N-F、PhoR-C-R进行第二轮PCR循环反应，将所得到PCR产物经DNA凝胶电泳鉴定后，分别命名为PhoP-K、PhoR-K以及PhoPR-K。

1.2.4PhoP、PhoR和PhoPR缺失突变载体的构建及鉴定各缺失突变片段分别与pMD 19-T Vector、Solution Ⅰ混合，进行片段与T Vector连接，随后将连接产物转入E.coliDH5α感受态细胞，并涂布于含有卡那霉素(100 μg/mL)及氨苄霉素(50 μg/mL)的LB双抗固体培养基，37 ℃倒置过夜培养。同时，pMD 19-T Vector、Solution Ⅰ混合后转入E.coliDH5α感受态细胞并培养为阴性对照A组，以判断pMD 19-T Vector是否存在自连现象；去离子水、Solution Ⅰ混合后转入E.coliDH5α感受态细胞并培养为阴性对照B组，以判断卡那霉素以及氨苄霉素抗生素是否失活。于次日挑取各组单个阳性克隆并接种于含有卡那霉素(100 μg/mL)及氨苄霉素(50 μg/mL)的LB双抗液体培养基，37 ℃震荡过夜培养。然后，取适量菌液为模板行PCR反应并DNA凝胶电泳分析后，将各缺失突变载体分别命名为T-PhoP、T-PhoR和T-PhoPR，并送至上海生工生物工程公司测序。分别将经测序成功的含有T-PhoP、T-PhoR和T-PhoPR的菌液与甘油混匀后放置于-80 ℃保存备用。

图1利用SOE-PCR和T vector克隆技术构建缺失突变载体的流程图

Fig.1Schematic chart for mutant vector constructed by using SOE-PCR and T vector cloning

2结果

2.1PhoP、PhoR和PhoPR缺失突变片段的构建及鉴定以结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv基因组DNA为模板，使用各自引物分别扩增得到PhoP上游同源臂片段PhoP-N(373 bp)、PhoP下游同源臂片段PhoP-C(476 bp)、PhoR上游同源臂片段PhoR-N(366 bp)、PhoR下游同源臂片段PhoR-C(464 bp)，并经DNA凝胶电泳分析，其片段大小与预期一致(图2)。以pUC19K质粒DNA为模板，使用引物扩增得到1 093 bp的卡那霉素抗性基因Kan，并经DNA凝胶电泳分析，其大小与预期一致(图3)。

M: DNA markerⅠ; 1: PhoP-N fragment; 2: PhoP-C fragment;3: PhoR-N fragment; 4: PhoR-C fragment.

图2PhoP和PhoR基因上下游片段PCR扩增结果

Fig.2PCR amplification of fragments upstream and downstream of PhoP and PhoR genes

M: DNA marker Ⅲ; 1: Kan gene fragment.

Fig.3PCR amplification of fragments upstream and downstream of Kan gene

将获得的PhoP-N、Kan、PhoP-C和PhoR-N、Kan、PhoR-C以及PhoP-N、Kan、PhoR-C分别按比例1∶2∶1混合，经首轮SOE-PCR循环反应可得到3组融合片段。3组融合片段分别作为第二轮PCR循环反应的模板并加入相应上、下游引物引物PhoP-N-F、PhoP-C-R和PhoR-N-F、PhoR-C-R以及PhoP-N-F、PhoR-C-R进行普通PCR循环反应扩增，从而获得缺失突变片段PhoP-K、PhoR-K以及PhoPR-K(图4)。

M: DNA marker Ⅲ; 1: PhoP-K fragment; 2: PhoR-K fragment; 3: PhoPR-K fragment.

图4SOE-PCR构建 PhoP和PhoR基因上下游突变片段的结果

Fig.4Construction of the mutant fragments upstream and downstream of the PhoP and PhoR genes by SOE-PCR

2.2PhoP、PhoR和PhoPR缺失突变载体的构建

及鉴定 以各缺失突变片段、pMD 19-T Vector、Solution Ⅰ混合，进行片段与T Vector的连接，并将连接产物转入E.coliDH5α感受态，涂布于卡那霉素(100 μg/mL)及氨苄霉素(50 μg/mL)的LB双抗固体培养基，经培养得到若干阳性克隆(图5)；以pMD 19-T Vector、Solution Ⅰ混合作为阴性对照1组与缺失突变片段进行连接，并转入E.coliDH5α感受态，涂布于卡那霉素(100 μg/mL)及氨苄霉素(50 μg/mL)的LB双抗固体培养基，经培养无E.coli生长，进而证实pMD 19-T Vector未发生载体自连现象；以去离子水、Solution Ⅰ混合作为阴性对照2组与缺失突变片段进行连接，并转入E.coliDH5α感受态，涂布于卡那霉素(100 μg/mL)及氨苄霉素(50 μg/mL)的LB双抗固体培养基，经培养无E.coli生长，进而证实培养基所添加的抗生素活性良好。

A: Positive clones of deletion mutant vector with PhoP-K; B: Positive clones of deletion mutant vector with PhoP-K; C: Positive clones of deletion mutant vector with PhoP-K.

图5氨苄霉素/卡那霉素双抗培养基筛选缺失突变载体

Fig.5Screening of transformed strains with deletion mutant in Amp/Kan resistant plate

挑取各组的单个阳性克隆接种于含有卡那霉素(100 μg/mL)及氨苄霉素(50 μg/mL)的LB双抗液体培养基，37 ℃震荡过夜培养。第二天，分别以各组的菌液为模板，使用相应上、下游引物PhoP-N-F、PhoP-C-R和PhoR-N-F、PhoR-C-R以及PhoP-N-F、PhoR-C-R进行菌落PCR扩增，分别得到扩增产物PhoP-K、PhoR-K以及PhoPR-K。分别提取各组质粒送至基因公司测序，测序结果与预期一致。因此，PhoP、PhoR和PhoPR缺失突变载体构建成功，分别命名为T-PhoP、T-PhoR和T-PhoPR。

3讨论

结核病是一种古老的传染性疾病，也是一种人兽共患传染病。直到19世纪80年代初，结核病的病原菌为结核分枝杆菌这一事实才被德国科学家Robert Koch发现并证明，从此拉开了结核病研究的帷幕[8]。我国于2010年在全国开展了第五次结核病流行病学调査，调查结果显示15岁及以上人群活动性肺结核的患病率为459/10万，涂阳肺结核患病率为66/10万，耐多药率为6.8%(19/280)[9]。中国作为22个结核病高负担国家之一， 2015年世界卫生组织所公布的全球结核病报告指出，我国新发耐多药结核病率为19%，复发耐多药结核病率为54%[10]。

基因敲除(gene knockout)技术属于反向的遗传学研究方法之一，通过特定技术使得生物体某个基因精确失活或缺失，与野生型生物体表型进行比对，并依据其变化而认识该基因的功能[11]，是基因功能研究中常用的方法之一[12]。对于病原菌某个基因的未知功能研究，快速且高效地成功构建该基因缺失突变菌株，可以显著提高该基因在致病机制或耐药机制等方面的功能研究的效率。结核分枝杆菌是一种胞内寄生菌，目前的研究显示其菌体内未发现质粒存在，且大部分其他来源的质粒也不能在其菌体内进行复制。故而，这些质粒均能够成为构建结核分枝杆菌某个基因突变株时所需的自杀载体。

高效自杀载体系统是上世纪80年代发展起来的染色体修饰技术，其基本原理是构建含一定长度同源DNA片段的重组自杀质粒，利用宿主自身的重组系统在同源重组序列间交换，由于自杀性载体的性质，在二次重组过程中进一步丢失上述重组质粒而完成重组[13]，该系统具有宿主范围广、可转移等特点[14]。pMD 19-T Vector是一种由pUC19质粒改建而来的PCR产物高效克隆载体，是两侧的3’端添加“T”的线性化T载体。基于大多数耐热性DNA聚合酶进行PCR循环反应时均在所得到的PCR产物3’末端添加“A” 的特点，所以pMD 19-T Vector能够显著提高与PCR产物的连接效率。由于其自身质粒的特点，即只能够在大肠埃希菌菌属中复制，因此，可作为自杀质粒应用于结核分枝杆菌目的基因缺失突变菌株的构建。

融合PCR(SOE-PCR)技术通过具有互补末端的引物使得PCR产物形成重叠链，并通过扩增反应中的不断延伸，从而将不同来源的片段进行拼接融合。在本实验中，首先通过SOE-PCR技术将待缺失基因上、下游的同源片段与卡那霉素抗性基因融合在一起，构建突变片段。由于在SOE-PCR第二轮扩增时使用的是Taq酶，因此PCR产物的3’末端自动加“A”尾，从而与T载体连接以得到含有卡那霉素抗性的突变载体。本实验结果表明利用该方法能够在体外进行高效连接，且不需要酶切处理后再连接的过程，明显简化了操作步骤，缩短了实验时间，提高了成功效率。

本实验利用SOE-PCR技术、T载体克隆技术构建结核分枝杆菌PhoPR双组分系统的缺失突变载体，证明了该方法的可行性。与此同时，该方法较传统方法来说，不仅操作简便，无需酶切连接等步骤，而且仅需一次筛选即可得到突变载体，具有明显的高效性。该方法的成功应用，为结核分枝杆菌突变载体的构建提供了快速有效的手段，从而为构建结核分枝杆菌突变菌株提供便利，也为结核分枝杆菌PhoPR双组分系统功能研究奠定基础。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.013

通讯作者：张万江，Email:zwj1117@sina.com

中图分类号：R378.91

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)03-0276-05

Corresponding author:Zhang Wan-jiang, Email: zwj1117@sina.com

收稿日期：2015-10-21；修回日期:2016-02-06

Establishment of an efficient method for deletion mutant vectors of PhoPR TCS in Mycobacterium tuberculosis by SOE-PCR and T vector cloning

WANG Jun,WU Fang,LIU Xiao-ling,LIANG Su,ZHANG Pei-pei,ZHANG Le,WU Jiang-dong,CAO Xu-dong,ZHANG Wan-jiang

(DepartmentofPathogenBiologyandImmunology,CollegeofMedicine/XinjiangKeyLaboratoryofEndemicandEthnicDisease/CenterofCollaborativeInnovationforHighZoonoticInfectiousDiseasePreventioninWesternRegionofXinjiangProductionandConstructionCorps,ShiheziUniversity,Shihezi832002,China)

Abstract:To establish a method for obtaining deletion mutant vectors of PhoPR TCS in M. tuberculosis, the upstream and downstream homologous arms of PhoP gene, PhoR gene and PhoPR gene were combined with kanamycin resistance gene by SOE-PCR, respectively. The fragment was connected to T vector and transfered into E. coli DH5α competent cell. Then the resistant colone was screened out, and then the deletion mutant vectors of PhoP, PhoR and PhoPR in M. tuberculosis were obtained. Results indicated that the deletion mutant vectors of PhoPR TCS were constructed successfully in a short time. It is a rapid and efficient method compared with the traditional method. In conclusion, the deletion mutant vectors constructed by SOE-PCR and T vector in this study would lay the foundation for the further study on constructing mutant strain of M. tuberculosis and related research.

Keywords:Mycobacterium tuberculosis; T vector; deletion mutant vector; construction

国家自然科学基金项目(No. 81260261，81160192)；石河子大学高层次人才启动专项(No.RCZX201446)