云南省恙虫病与肾综合征出血热混合感染的诊断及分析

亚红祥，张云智



云南省恙虫病与肾综合征出血热混合感染的诊断及分析

亚红祥，张云智

云南省地方病防治所/云南省自然疫源性疾病防控技术重点实验室，大理671000;

摘要：目的调查云南省不明原因发热患者中是否存在恙虫病与肾综合征出血热混合感染病例。方法采用间接免疫荧光法和胶体金法检测不明原因发热患者血清中的恙虫病东方体(OT)抗体及肾综合征出血热(HFRS)病毒抗体，用巢式PCR扩增患者血液中的OT 基因sta56片断与汉坦病毒(HV)基因L片断。结果79例患者中，实验室确诊HFRS 5例、恙虫病3例、HFRS与恙虫病混合感染4例；巢式PCR检测到HV L片断核酸2例(DLR2和DLR6), 序列分析两者间的同源性100%，DLR2与老挝汉城病毒L0199株核苷酸序列同源性最高为94.6%, 与中国汉城病毒L99株的同源性80.5%, 与云南汉坦病毒YN06-256的同源性69.8%。结论首次证实云南省存在恙虫病与肾综合征出血热混合感染病例，其HFRS病原体遗传进化关系与老挝汉城病毒L0199株密切相关。

关键词：恙虫病；肾综合征出血热；不明原因发热；混合感染；云南省

肾综合征出血热( Hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)和恙虫病(Scrub typhus，ST)分别由汉坦病毒(Hantavirus,HV) 和恙虫病东方体(Orientiatsutsugamushi,OT)感染引起的严重危害人类健康的自然疫源性疾病[1-2]。在早期临床上两病常常缺乏特异性，极易发生误诊，延误治疗可致多脏器受累，甚至死亡[3-6]。我国HFRS和恙虫病疫区分布较为广泛，病例数较多，疫情十分严重，目前已成为非常突出的公共健康问题[7-8]。恙虫病是威胁旅游者健康的重要传染病之一[9]，云南为我国旅游大省，又是恙虫病流行的主要省份，近年来恙虫病病例较多[8,10]，肾综合征出血热病例也时有发生[11-12]，然而恙虫病与肾综合征出血热混合感染较为罕见。现将恙虫病与肾综合征出血热混合感染的实验室诊断及分析如下：

1材料与方法

1.1材料2010-2013年收集到云南省各医疗机构送检的不明原因发热患者(起病急，持续发热3天以上, 发病前3周内有野外活动史)血液79份，分离血清用于抗体检测和RNA提取，血块用于核酸提取，并收集病例资料。

1.2方法

1.2.1间接免疫荧光试验(Indirect immunoinfluscent assay, IFA)用PBS从1∶16开始对患者血清作系列稀释至1∶512，将各稀释度血清分别加至OT(Karp型)抗原片(中国CDC传染病所)和HFRS病毒(HV)抗原片(浙江省CDC)孔内，放入湿盒37 ℃孵育45 min，用PBS洗片3次，每次1～2 min，吹干，加入荧光素标记的羊抗人IgG抗体(KPL公司)，放入湿盒37 ℃孵育30 min，用PBS洗片3次，每次1～2 min，吹干，用Nikon荧光显微镜观察结果。分别以HV IgG效价≥32和OT IgG效价≥64作为阳性参考值。

1.2.2胶体金免疫试验(Colloidal gold immunoassay assay,CGIA)参照胶体金法肾综合征出血热病毒(HV)抗体诊断试剂盒(厦门市波生生物技术有限公司，批号：H12061901)和胶体金法恙虫病东方体(OT)抗体检测试剂盒(厦门市波生生物技术有限公司，批号：H12090304)说明书操作，分别进行HV抗体IgG和IgM及OT抗体IgG和IgM检测。

1.2.3巢式PCR (nPCR)检测用基因组DNA提取试剂盒(百泰克公司)对患者血块提取总DNA，应用文献[13]中的引物(上海生工公司合成)及条件对OTsta56基因进行扩增。用QIAamp viral RNA Mini kit(Qiagen公司)对患者血清提取总RNA，应用文献[14]中的引物(上海生工公司合成)对HV L片断进行扩增，并应用逆转录试剂盒(Fermentas)，利用六碱基随机引物合成cDNA。PCR反应总体积为25 μL, 应用Promega公司GoTaqGreen Master Mix(2×)试剂盒在Biometra TProfessional PCR仪中进行二次PCR扩增，以无菌水为阴性对照，无阳性对照。第一次扩增时取6 μL被检标本DNA或cDNA为模板，第二次扩增时取第一次扩增产物1 μL作为模板。取二次PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶检测，DNA标准为DL2000。

1.2.4基因序列测定及分析PCR阳性产物送上海生工公司进行序列测定。将所得到的序列通过Internet网进入美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)站点后，利用BLAST工具以及采用DNAstar中的MegAlign软件对序列进行同源性比较，运用MEGA6.06软件Neighbor-joinjing法(Bootstrap值设定为1 000)构建系统进化树。

2结果

2.1病例资料收集到病例79份资料，年龄在5～71岁，男∶女性别为41/38，其中农民55例、学生10例、其他和职业不明的14例，2010年17例、2011年14例、2012年33例、2013年发病15例；均有发热，体温在38～41℃，多数呈弛张热型，持续发热4～26 d，伴有畏寒、寒战、咳嗽、咳痰、全身酸痛、乏力、食欲减退、腰痛、结膜充血、尿少、肝脾肿大、皮疹、焦痂或溃疡等；病前1～3周到过田间劳作或野外活动，一些居住区可见老鼠活动。

2.2IFA检测对79例患者血清进行HV IgG抗体检测，结果抗体效价≥1∶32的有12例，阳性率15.19%。对HV IgG抗体效价≥1∶16的18例患者血清进行OT IgG抗体检测，结果有10例抗体效价≥1∶64(阳性率58.82%)。同时检测到HV和OT IgG抗体的有4例(表1，2)。

2.3胶体金法检测对HV IgG抗体效价≥1∶16的18例患者血清分别进行HV 抗体IgG和IgM及OT抗体IgG和IgM检测，结果HV抗体阳性11例(仅IgG阳性2例、仅IgM阳性3例、两种抗体均阳性6例)，OT抗体阳性10例(仅IgG阳性3例、仅IgM阳性1例、两种抗体均阳性6例)(表1)。同时检测到HV和OT IgM抗体的有4例(表2)。

2.4nPCR检测及序列分析对IFA检测到HV IgG抗体效价≥1∶16的18例患者标本分别进行nPCR OT 基因sta56片断和HV 基因L片断检测，结果有2例扩增到约390 bp大小的L基因目的片断(图1)，OT 基因sta56片断扩增均为阴性。

根据汉坦病毒L基因部分序列应用MegAlign软件将测序获得的样本序列(353 bp)与GenBank中的已知的汉坦病毒L基因部分核苷酸序列进行同源性比较，结果序列DLR2与DLR6的同源性100%，DLR2(基金序列注册号：KF977219)与老挝汉城病毒L0199株的同源性最高，为94.6%；与汉城病毒Humber株的同源性82.2%, 与中国汉城病毒L99株的同源性80.5%, 与云南汉坦病毒YN06-256的同源性69.8%。

表1　IFA与CGIA 检测HV和OT抗体结果

Note: a, CGIA -positivefor IgG or IgM, and IgG and IgM; b, Calculated as (No.of CGIA-positive for HV / no.of IFA-positive for HV)×100 or (No.of CGIA-positive for OT / no.of IFA-positive for OT)×100.

表2HV和OT抗体检测同时阳性结果

Tab.2Antibody of HV and OT positive concurrently between IFA and CGIA

No.patientsIFAtitersHVIgGOTIgGCGIAdetectionHVIgMOTIgMDLR11∶1281∶512PositivePositiveDLR21∶2561∶512PositivePositiveDLR131∶321∶128PositivePositiveDLR141∶641∶64PositivePositive

2.5构建系统进化树将DLR2核苷酸序列(353 bp)与GenBank中的已知的汉坦病毒L基因部分核苷酸序列构建系统发育进化树，结果显示DLR2病

Note: M: DL2000 DNA Marker; 1: DLR1; 2: DLR2; 3: DLR3; 4: DLR4; 5: DLR5; 6: DL6; 7: DLR7; 8: DLR8; 9: DLR9.

图1nPCR扩增HV基因L片断部分结果

Fig.1Partial result of nPCR detection by HV L segment specific primers

毒与老挝汉城病毒L0199株在同一分支上，亲缘关系最近, 与中国汉城病毒L99株的亲缘关系较远，与云南汉坦病毒YN06-256的亲缘关系更远(图2)。

图2　根据HV L基因部分序列构建系统进化树

2.6病例诊断IFA和CGIA两种方法检测HV抗体结果中相符的有11例，符合率91.67%；检测OT抗体结果中相符的有10例，符合率100%(表1)。根据《恙虫病预防控制技术指南》(2009年中控疾发1号文件)和《流行性出血热诊断标准》(ws278-2008)，结合患者病例资料和实验室检测结果进行综合分析，临床病例HFRS 2例、恙虫病3例，实验室确诊病例HFRS 5例、恙虫病3例、HFRS和恙虫病混合感染病例4例(表3)。

3讨论

云南省地处中国西南边陲, 位于东经97°31′39″-106°11′47″和北纬21°8′32″-29°15′18″，属高原地形, 海拔在76.4～6740 m, 以热带和亚热带气候为主，年降雨量均在1 000 mm以上。该省与恙虫病高发的缅甸、老挝、越南接壤，地理和自然环境复杂多样，存在恙虫病、HFRS等多种自然疫源性疾病[12,15]。该省恙虫病和HFRS分布较为广泛，许多地区同时存在恙虫病和HFRS流行区，家鼠为恙虫病和HFRS的主要传染源和宿主动物，两病均可经恙螨传播，恙虫病的流行高峰为5～11月，这也正与当地HFRS的流行高峰期一致[12,16]，致使两者共同感染同一机体成为可能。近年来云南恙虫病病例增多，局部地区时有恙虫病暴发疫情发生[17-18]，HFRS疫区范围不断扩大，发病数也明显上升，恙虫病和HFRS患者时有被误诊[19-20]，通常需要借助实验室检测手段才能对它们进行诊断与鉴别。

表3　实验室确诊病例资料

本次研究应用胶体金和IFA方法对患者血清进行实验室检测，结合患者临床发病情况和实验室检测结果进行综合分析，实验室确诊HFRS患者5例、恙虫病患者3例、HFRS和恙虫病混合感染患者4例，这是首次证实云南地区存在恙虫病与HFRS混合感染病例。在临床上恙虫病和HFRS常常表现不典型，易与其它发热性疾病相混淆[19-20]。两病具有一些相同的临床表现，如发热，头痛，肌肉酸痛，结膜充血等，致使两者难以区分[4-5,21]。若恙虫病与HFRS混合感染于同一患者，更加增添了临床医生对病人的诊断难度，同时也可能加大对患者机体的损害程度，应引起医务工作者的高度重视。

云南素有动植物王国之称，宿主动物和媒介种类繁多，鼠类异常丰富，以往已证实鼠中存在HV和OT[16,22-23 ]，人们深受恙虫病和HFRS的危害[12,16]。该省主要存在以褐家鼠和黄胸鼠为主要宿主动物的家鼠型HFRS疫源地[16]，其HFRS病原体为汉城型病毒。本次检测发现云南省大理患者感染的HFRS病毒DLR2株与老挝黄胸鼠中汉城病毒L0199株的同源性最高为94.6%，而与中国L99株和云南YN06-256株的同源性分别为80.5%和69.8%，提示DLR2株可能为汉城病毒的一个新的亚种。本次流行的HFRS病毒与老挝黄胸鼠中的汉城病毒L0199株亲缘关系较近, 提示本次流行的病毒很有可能与东南亚国家老挝汉城病毒的传入有关。以往已证实云南黄胸鼠中存在汉坦病毒，该省黄胸鼠数量庞大，人们随时都有机会与黄胸鼠发生直接或间接接触，然而本次发生的HFRS患者是否由当地宿主动物黄胸鼠传播所致，还有待于进一步研究证实。本次发现具有重要的流行病学意义，为今后HFRS疫源地深入调查及宿主动物与疾病关系的研究提供科学线索。

参考文献：

[1]Tamura A, Ohashi N, Urakami H, et al. Classification ofRickettsiatsutsugamushiin a new genus, orientia gen. nov., asOrientiatsutsugamushicomb. Nov[J]. Int J Syst Bacteriol, 1995, 45(3): 589-591.

[2]Muranyi W, Bahr U, Zeier M, et al. Hantavirus infection[J]. J Am Soc Nephrol, 2005, 16(12): 3669-3679.

[3]Jonsson CB, Figueiredo LTM, Vapalahti O. A global perspective on Hantavirus ecology, epidemiology, and disease[J]. Clin Microbiol Rev, 2010, 23 (2): 412-441.

[4]Liu YX, Feng D, Zhang Q, et al. Key differentiating features between scrub typhus and hemorrhagic fever with renal syndrome in northern China[J]. Am J Trop Med Hyg, 2007, 76(5): 801-805.

[5]Basnyat B, Belbase RH, Zimmerman MD, et al. Clinical features of scrub typhus[J]. Clin Infect Dis, 2006, 42(10): 1505-1506.

[6]Cracco C, Delafosse C, Baril L, et al. Multiple organ failure complicating probable scrub typhus[J]. Clin Infect Dis, 2000, 31(1): 191-192.

[7]Zhang YZ, Zou Y, Fu ZF, et al. Hantavirus infections in human and animal，China[J]. Emerg Infect Dis, 2010, 16(8): 1195-1203.

[8]Zhang WY, Wang LY, Ding F, et al. Scrub typhus in Mainland China, 2006-2012: The need for targeted public health interventions[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2013, 7(12): e2493.

[9]Jensenius M, Fournier PE, Raoult D. Rickettsioses and the international traveler[J]. Clin Infect Dis, 2004, 39(10): 1493-1499.

[10]Ya HX, Wang JL. Serotyping and sequence analysis ofOreintiatsutsugamushifrom patients with fever of unknown origin in Dali, Yunnan[J]. Chin J Zoonoses, 2013, 29(9): 899-903. (in Chinese)

亚红祥, 王静林. 云南大理地区恙虫病血清学诊断及病原体基因序列分析[J].中国人兽共患病学报，2013,29(9):899-903.

[11]Zhang YZ, Zhang HL, Dong XQ, et al. Hantavirus outbreak associated with laboratory rats in Yunnan, China[J]. Infect Genet Evol, 2010, 10(7): 638-644.

[12]Yunnan preventive medicine association/Yunnan provincial center for disease control and prevention. Yunnansheng Zhongdian Chuanranbing Fangzhi Zhinan[M]. Kunming: Yunnan Science & Technology Press, 2004, 10: 289-433. (in Chinese)

云南省预防医学会/云南省疾病预防控制中心.云南省重点传染病防治指南[M]. 昆明:云南科技出版社, 2004,10: 289-433.

[13]Ree HI, Kim TE, Lee IY, et al. Determinationmand geographical distribution ofOrientiatsutsugamushiserotypes in Korea by nested polymerase chain reaction[J]. Am J Trop Med Hyg, 2001, 65(5): 528-534.

[14]Klempa B, Fichet-Calvet E, Lecompte E, et al. Hantavirus in African Wood Mouse, Guinea[J]. Emerg Infect Dis, 2006, 12(5): 838-840.

[15]Kelly DJ, Fuerst PA, Ching WM, et al. Scrub typhus: the geographic distribution of phenotypic and genotypic variants ofOrientiatsutsugamushi[J]. Clin Infect Dis, 2009, 48(S3): S203-230.

[16]Ya HX, Zhang HL, Zhang YZ, et al. Investigation on hemorrhagic fever with renal syndrome in the west of Yunnan province, China[J]. Endem Dis Bull, 2007, 22(4): 19-22. (in Chinese)

亚红祥,张海林,张云智, 等. 2004-2005年滇西地区肾综合征出血热调查[J]. 地方病通报, 2007, 22(4): 19-22.

[17]Li L. 29 cases of tsutsugamushi disease from a primary school[J]. Pract Clin Med, 2006, 7(3): 150. (in Chinese)

李丽. 小学生恙虫病29例集体发病临床分析[J]. 实用临床医学, 2006,7(3):150.

[18]Zhang YB, Zhang LY, Chen LX. Investigation on a scrub typhus outbreak in Eshan County, Yunnan[J]. Med Pharm Yunnan, 2014, 35(1): 64. (in Chinese)

张玉宝，张丽英，陈利新. 峨山一起恙虫病暴发的调查报告[J]. 云南医药, 2014, 35(1): 64.

[19]Jin SH. Causes of misdiagnosis of 35 cases of epidemic hemorrhagic fever and measures to eliminate misdiagnosis[J]. J Pathog Biol, 2010, 5(5): 396. (in Chinese)

靳寿华. 流行性出血热35 例误诊原因及减少误诊措施探讨[J]. 中国病原生物学杂志, 2010,5(5): 396.

[20]Wu CY. Analysis of 26 misdiagnosis cases of tsutsugamushi disease[J]. Parasitoses Infect Dis, 2006, 4(4): 216. (in Chinese)

武春云. 恙虫病26例误诊分析[J]. 寄生虫病与感染性疾病, 2006, 4(4):216.

[21]Du H, Wang PZ, Li J, et al. Clinical characteristics and outcomes in critical patients with hemorrhagic fever with renal syndrome[J]. BMC Infect Dis, 2014, 14(1): 191.

[22]Zhang YZ, Yuan JF, Yang XL, et al. A novel hantavirus detected in Yunnan red-backed vole (Eothenomysmiletus) in China [J]. J Gen Virol, 2011, 92: 1454-1457.

[23]Ya HX, Zhang YZ, Wang JL. Investigation on rickettsiae infection among rodents and ticks in Hengduan Mountains, west of Yunnan province[J]. Chin J Epidemiol, 2014, 35(5): 614-615. (in Chinese)

亚红祥，张云智，王静林.滇西横断山区鼠类及蜱自然感染立克次体调查[J].中华流行病学杂志，2014,35(5):614-615.

DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.011

中图分类号：R376

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)03-0266-05

收稿日期：2015-05-15；修回日期:2015-08-01

Cases with coinfected hemorrhagic fever with renal syndrome and scrub typhus in Yunnan, China

YA Hong-xiang,ZHANG Yun-zhi

(YunnanInstituteofEndemicdiseasesControlandPrevention/YunnanCenterofVirusandRickettsiaResearch/YunnanKeyLaboratoryofNaturalFocusDisease,Dali671000,China)

Abstract:We identified the pathogen of patients with fever with unknown origin and determine whether they were coinfected cases with scrub typhus (ST) and hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) in Yunnan, China. Seventy-nine blood samples from patients with fever of unknown origin were collected and sera were tested for antibody of OT and HV with indirect immunoinfluscent assay (IFA) and colloidal gold immunoassay assay(CGIA), respectively. OT sta56 gene and HV L gene in blood of patients were examined by nested PCR (nPCR), and sequenced and analyzed the homology with other known sequences. The 5 out of 79 patients were HFRS cases, 3 were scrub typhus cases, and 4 were coinfected cases with scrub typhus and HFRS. HV gene L fragments were amplified successfully by nPCR in 2 cases (DLR2 and DLR6); the homology was 100% through comparing their L gene sequence. DLR2 shared highest homology (reach up to 94.6%) with Seoul virus L0199 strains from Laos, while the homology of DLR2 compared with Seoul virus L99 strains from China and HV YN06-256 strains from Yunnan of China was only up to 80.5% and 69.8%, respectively. It was the first evidence that there were coinfected cases with scrub typhus in Yunnan, and the HFRS pathogen is closely related to Laos Seoul virus L0199 strains in genetic evolution relationship.

Keywords:Scrub typhus; hemorrhagic fever with renal syndrome; fever with unknown origin; coinfection; Yunnan Province

Email: yahongxiang@163.com