婴幼儿配方奶粉中3-氯丙醇酯的GC-MS法测定及暴露危险分析

许欣欣，陈慧玲，刘红河，康　莉，毛丽莎

(深圳市疾病预防控制中心，广东深圳　518055)



婴幼儿配方奶粉中3-氯丙醇酯的GC-MS法测定及暴露危险分析

许欣欣，陈慧玲，刘红河，康莉，毛丽莎

(深圳市疾病预防控制中心，广东深圳518055)

摘要：目的：建立婴幼儿配方奶粉中3-氯丙醇酯的气相色谱—质谱联用(GC-MS)测定方法，并对部分市售婴幼儿配方奶粉中3-氯丙醇酯的含量进行调查。方法：用乙醚+石油醚(1∶1)提取奶粉样品中脂肪，以1 mL甲醇钠甲醇溶液(0.25 mol/L)将脂肪中的3-氯丙醇酯(3-MCPD酯)水解成3-氯丙醇(3-MCPD)并用硅藻土小柱净化后，经七氟丁酰基咪唑衍生，再用选择离子监测的气相色谱—质谱联用法测定，采用内标法定量。结果：3-MCPD酯在250～5 000 μg/kg范围内线性良好(r>0.999)，3个浓度水平下加标回收率为71.5%～99.6%，相对标准偏差为2.3%～6.0%。20份奶粉样品中，检出率65%，含量为0.26～0.97 mg/kg脂肪、0.042～0.22 mg/kg样品。不同阶段统计婴幼儿配方奶粉平均暴露量，一阶段 3.32 μg/(kg·bw)、二阶段 2.42 μg/(kg·bw)、三阶段 2.72 μg/(kg·bw)、四阶段 0.23 μg/(kg·bw)。结论：该方法灵敏度高、定量准确度，适合婴幼儿配方奶粉中3-氯丙醇酯的检测。

关键词：气相色谱—质谱联用；3-氯丙醇酯(3-MCPD酯)；婴幼儿配方奶粉

氯丙醇类化合物是公认的食品污染物，具有生殖、肾脏和神经毒性以及潜在致癌作用[1]。氯丙醇脂肪酸酯(氯丙醇酯)在生物体内脂肪酶的作用下分解成氯丙醇[2]，是近年来发现的一类新型食品污染物，在油和含油脂食品中的污染水平较高[3-6]。其中，3-氯-1，2丙二醇(3-MCPD)脂肪酸酯(简称3-MCPD酯)毒性最强、最典型、污染水平最高，因此备受关注[7]。2008年FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会将3-MCPD 酯列为优先评价的化合物。2015年国家食品污染和有害因素风险监测工作手册也收录了食品中3-MCPD 酯的检测。

由于氯丙醇酯的食品安全问题发现时间不长，且主要发现于精炼植物油中，因此有关食品中氯丙醇酯的报道不多，检测的样品也以食用油最为常见[8-10]，有关其他食品基质中氯丙醇酯的报道较少[11]。目前报道的食品中氯丙醇酯检测方法主要分直接法和间接法：直接法采用液相色谱质谱(LC-MS)测定某个或某些氯丙醇酯本身，前处理相对简单[12,13]，但因氯丙醇酯种类较多且标准品不易获得而影响该方法推广；间接法为采用水解方式将氯丙醇酯转化为氯丙醇，再进行衍生化，采用气相色谱质谱法(GC-MS)测定其总量，该方法测定各种氯丙醇酯总量，更加适合膳食暴露研究。氯丙醇酯水解转化为氯丙醇的方式主要有酸水解、碱水解和酶水解等[14]。衍生化常用试剂有七氟丁酰基咪唑[15]、苯基硼酸[16，17]和丁基硼酸[18，19]。由于棕榈油在婴幼儿配方奶粉中广泛使用[20]，国际上已有奶粉中检测出氯丙醇酯的相关文献发表[21]。本研究以婴幼儿配方奶粉为研究对象，采用碱水解—七氟丁酰基咪唑衍生化法对样品进行前处理，以气相色谱—质谱法(GC-MS)测定3-MCPD酯含量，并对深圳市售婴幼儿配方奶粉的氯丙醇酯污染状况进行初步研究。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

Agilent 7890A-5975C气相色谱质谱联用仪(美国Agilent公司)；XS-205DU十万分之一天平( 瑞士梅特勒-托利多公司)；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)；R-210旋转蒸发仪(瑞士BUCHI)，KQ-250DV超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，WL-S26恒温水浴锅(上海精宏仪器有限公司)，MS3型漩涡振荡器(德国IKA公司)。

3-氯-1，2-丙二醇标准品(3-MCPD，纯度98.4%，德国SIGMA-ALDRICH公司)；d5-3-氯-1，2-丙二醇标准品(d5-3-MCPD，纯度97%，加拿大TRC公司)；3-氯-1，2-丙二醇棕榈酸单酯标准品 (3-MCPD-P)、d5-3-氯-1，2-丙二醇棕榈酸单酯标准品(d5-3-MCPD-P)(纯度均大于99%，日本和光(Wako)纯药工业株式会社)；正己烷、甲醇、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、乙醇、乙醚、石油醚(均为色谱纯，美国Merck公司)；氨水、冰乙酸、氯化钠(分析纯)；甲醇钠(分析纯)；无水硫酸钠(优级纯，经450℃烘烤8h后使用)；ChemElutTM硅藻土小柱(美国Agilent公司)；七氟丁酰基咪唑(HFBI，德国SIGMA-ALDRICH公司)，载气为高纯氦气。

1.2标准溶液的配制

精确称取各标准品10 mg(精确至0.01 mg)置于10 mL 棕色容量瓶中，以乙酸乙酯为溶剂定容至刻度，分别制备浓度为1 000 mg/L 的标准储备液，保存于-20 ℃冰箱。将各标准储备液再用正己烷逐级稀释，配制成浓度为10.0 mg/L 的标准使用液。

1.3样品来源

5个品牌共20份婴幼儿配方奶粉样品，购于深圳市各大超市，其中一段配方奶粉(0～6个月)5份、二段配方奶粉(6～12个月)5份、三段配方奶粉(12～36个月)5份、四段配方奶粉(3岁以上)5份。

1.4方法

1.4.1样品预处理准确称取4 g(精确至0.01 g)样品置于100 mL具塞玻璃试管中，加入20 mL预先准备好的65 ℃热水，涡旋振荡待其混匀后，冷却至室温。向冷却后的样品溶液中加入8 mL氨水，盖塞后涡旋混匀，放入65℃水浴中加热30 min。向试管中加入10 mL乙醇，混合摇匀后加入25 mL乙醚，涡旋1 min后加入25 mL石油醚，继续涡旋30 s。静置30 min，待其完全分层后，取上层溶液倒入预先称重的蒸发皿。再加入 15 mL乙醚和15 mL石油醚，重复提取2次，将上层液一并转移至蒸发皿中。将蒸发皿放于65 ℃水浴，加热去除溶剂，擦去蒸发皿外壁水分，冷却至室温后称重，精确至0.1 mg，前后2次的差值即为脂肪的重量。提取的脂肪置于4 ℃冰箱中保存。

1.4.2样品水解与净化准确称取0.1 g脂肪(精确至0.1 mg)，加入10 mg/L的D5-3-MCPD-P内标使用液60μL和甲基叔丁基醚-乙酸乙酯(8：2，V/V)500 μL，涡旋混匀。加入1mL甲醇钠/甲醇溶液(0.25 mol/L)，涡旋混匀，反应4 min，加入100 μL冰乙酸，涡旋混匀，再加入3 mL 20 %的氯化钠溶液和3 mL正己烷，涡旋1 min，弃去上层溶液。加入3 mL正己烷重复萃取1次，将下层水相溶液转入ChemElutTM 硅藻土小柱中，平衡静置5 min。加入30 mL正己烷淋洗弃去，再用80 mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液旋转蒸发近干，用2mL正己烷复解残渣。

1.4.3样品衍生化参照GB/T5009.191-2006(第二法)食品中氯丙醇多组分含量的测定方法对处理好的样品进行衍生。用气密针迅速加入七氟丁酰基咪唑50 μL，立即密塞。涡旋充分混合后，于75 ℃烘箱保温30 min。取出后，放置室温并加20 %饱和氯化钠溶液2 mL，涡旋混合，静置使两相分离。移取上层溶液到预先加有少许无水硫酸钠的2 mL样品瓶中，放置1 min，将样品液转移至另一2 mL样品瓶中待测。

1.4.4测定条件色谱条件：色谱柱：DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱流量：1.0 mL/min；柱压力：20 psi；程序升温：50 ℃保持1 min，2 ℃/min升至90 ℃，再40 ℃/min升至250 ℃，保持5 min；进样口温度：250 ℃；不分流进样，进样体积1 μL。

质谱条件：传输线温度：280 ℃；离子源温度：230 ℃；EI电压：70 eV；溶剂延迟5 min；以M/Z 253作为3-MCPD的定量离子，以M/Z 257作为d5-3-MCPD的定量离子，按内标法计算结果。

2结果与分析

2.1样品前处理条件优化

2.1.1甲醇钠用量目前测定氯丙醇酯多采用甲醇钠进行碱水解，即酯键断裂反应。比较1.0 mL甲醇钠甲醇溶液(0.25 mol/L)和1.0 mL甲醇钠甲醇溶液(0.5 mol/L)，发现使用甲醇钠甲醇溶液(0.5 mol/L)时，多次实验结果偏差较大，可能是因为浓度较高，甲醇钠有部分析出，导致加入量偏差增大。比较0.2、0.5、1.0和2.0 mL甲醇钠甲醇溶液(0.25 mol/L)水解1 min时的响应，当使用1 mL时3-MCPD响应最高。

2.1.2水解时间德国脂肪科学(DGF)方法的水解时间为10 min，有研究报道认为应为1 min或4 min。本实验使用1.0 mL甲醇钠甲醇溶液(0.25 mol/L)，设定水解时间为0.5、1.0、4.0和10.0 min，结果显示，在4 min时3-MCPD响应最高。

2.2方法学验证

由于不同种类的3-氯丙醇酯在样品前处理过程中均水解为3-MCPD进行衍生化及GC-MS测定，在计算3-氯丙醇酯的含量时以3-MCPD计。因此，标准系列溶液直接用3-MCPD标准溶液配制，以3-MCPD的色谱峰面积(A)和内标的色谱峰面积(Ai)的比值对相应的标准溶液中3-MCPD的浓度进行线性回归计算，得出线性方程、线性范围和相关系数(r)。在250～5 000 μg/kg范围内，3-MCPD呈良好线性关系，线性方程Y=1.61X+127，r大于0.9995。以信噪比为3的含量作为方法的检出限、以信噪比为10的含量作为方法的定量限，得到3-MPCD 酯检出限为30 μg/kg、定量限为100 μg/kg。

本试验以3-MCPD棕榈酸酯为氯丙醇酯的代表物加入到奶粉样品中作为标准添加物质，进行3-MCPD酯的加标回收试验。取空白脂肪样品分别进行500、1 000 和2 500 μg/kg脂肪3个水平的加标回收试验，重复测定6次，3-MCPD 酯的回收率为71.5%～99.6%，相对标准偏差为2.3%～6.0%。加标回收试验结果说明，方法的精密度和准确度良好。

2.3婴幼儿配方奶粉中氯丙醇酯的污染状况

2.3.1暴露评估方法对采集样品按婴幼儿发育阶段分为一阶段(0～6个月)、二阶段(6～12个月)、三阶段(12～36个月)、四阶段(3岁以上)等四类。参考婴幼儿喂养要求和奶粉冲调要求，前三阶段按婴幼儿体重计算奶粉摄入量，第四阶段直接引用乳幼儿制品建议摄入量(250 mL/d)[22]，各阶段婴幼儿配方奶粉摄入量及体重[23，24]信息见表1。由于目前尚无3-MCPD酯的安全摄入量，暂时以3-MCPD的最大耐受剂量(provisional maxiumum tolerable daily intake，PMTDI)[2μg/(kg·d)]进行评估。计算公式为(1)式：

暴露量I=1 000×C×S/1 000/M

(1)

(1)式中，I：3-MCPD酯摄入量，μg/(kg·d·bw)；C：奶粉中3-MCPD酯的含量，mg/kg样品；S：每日婴幼儿配方奶粉消费量，g；M：婴幼儿体重，kg。

表1　各阶段婴幼儿配方奶粉日摄入量和婴幼儿体重

2.3.2结果本试验采集了20份婴幼儿配方奶粉，检出率65%，含量0.26～0.97 mg/kg脂肪、0.042～0.22 mg/kg样品(表2)。按不同阶段统计婴幼儿配方奶粉平均暴露量，一阶段 3.32 μg/(kg·bw)、二阶段 2.42 μg/(kg·bw)、三阶段 2.72 μg/(kg·bw)、四阶段 0.23 μg/(kg·bw)。结果表明，一阶段婴幼儿的3-MCPD酯暴露水平较高，是PMTDI的1.66倍，这主要是由于一阶段奶粉脂肪含量较高，且新生儿体重较低；而四阶段针对幼儿，这一阶段幼儿奶粉摄入量少，体重较重，所以暴露水平较低。

3结论

本次建立的婴幼儿配方奶粉中3-氯丙醇酯的气相色谱质谱联用法(GC-MS)测定分析方法，提取样品脂肪，再依次用碱水解和硅藻土小柱净化，收集洗脱液旋转蒸发近干，残渣用正己烷溶解，七氟丁酰基咪唑衍生化，气相色谱与串联质谱联用仪测定，采用内标法定量。对方法的线性范围、检出限、精密度和准确度等技术参数进行评价，用此法检测了市售20份婴幼儿配方奶粉中3-氯丙醇酯的含量，初步对婴幼儿配方奶粉的3-MCPD酯暴露量进行了评估。结果显示，样品中3-MCPD酯检出率高达65%(13/20)，其中暴露水平超过PMTDI的有6份，特别一阶段婴幼儿的3-MCPD酯暴露水平较高，5份样品有4份暴露量超过PMTDI限值。对于身体各方面发育都不成熟的婴幼儿来说，过量有毒有害物暴露可导致比成人更严重的危害。为了保护婴幼儿的安全，采取相应措施降低配方奶粉中的污染十分必要。生产厂家应该谨慎选择原料，并通过改善加工工艺来降低婴幼儿配方奶粉中氯丙醇酯的污染。本研究将继续增大奶粉样品的品牌和数量，以得到更加准确的结论。◇

表2　婴幼儿配方奶粉3-MCPD酯测定含量及暴露量

注：样品编号1～5为一阶段、6～10为一阶段、11～15为一阶段、16～20为一阶段。

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(责任编辑李婷婷)

基金项目：深圳市科技创新委员会知识创新计划基础研究项目“深圳市居民膳食中新型污染物氯丙醇酯的暴露状况研究”(项目编号：JCYJ20140410170519145)。

作者简介：许欣欣(1984—)，女，硕士，主管技师，研究方向：卫生检验。

Determination of 3-Chloro-1，2-propanediol (3-MCPD)Esters in Infant Formula Milk Powder by Using Gas Chromatography/Mass Spectrometry and Exposure Level Analysis

XU Xin-xin，CHEN Hui-ling，LIU Hong-he，KANG Li，MAO Li-sha

(Shenzhen Center for Disease Control and Prevention，Shenzhen 518055，China)

Abstract：ObjectiveTo establish a determination method of 3-Chloro-1，2-propanediol (3-MCPD)esters in infant formula milk powder by GC-MS，and investigate 3-MCPD esters residues in 20 kinds of infant formula milk powders from supermarket.MethodFat was extracted with Ether-Petroleum Ether (1：1)from infant formula milk powder，followed by hydrolyzed with 1.0 mL sodium methylate solution(0.25 mol/L，inmethanol)，and purified by matrix solid-supported liquid-liquid extraction.After being derivatized with heptafluorobutyrylimidazole(HFBI)，3-MCPD esters were determined using GC-MS in SIM mode quantitativing by internal standard method.ResultThe method enjoyed a good linear and the detection limits were in the range of 250～5 000 μg/kg (r>0.999).The recoveries of the method were 71.5%～99.6% and the relative standard derivation were 2.3%～6.0%.In 20 kinds of infant formula milk powders，3-MCPD esters were detected at the range of 0.26～0.97 mg/kg fat and 0.042～0.22 mg/kg sample and the detection rates were 65%.Statistical average exposure levels at different stages of infant formula milk powders were 3.32 μg/(kg·bw) for one stage，2.42 μg/(kg·bw)for two stage，2.72 μg/(kg·bw) for three stage and 0.23 μg/(kg·bw) for four stage.ConclusionThe method had higher sensitivity and accuracy，which could be applied to detect 3-Chloro-1，2-propanediol esters in infant formula milk powder.

Keywords：GC-MS；3-Chloro-1，2-propanediol (3-MCPD)esters；infant formula milk powder