大剂量维生素D3补充对糖尿病大鼠胰岛及肌肉细胞组织学的影响

窦晓娟，汪求真，郝海波，郭玉妹，蔺瑞函，马爱国

(青岛大学医学院，山东青岛　266000)



大剂量维生素D3补充对糖尿病大鼠胰岛及肌肉细胞组织学的影响

窦晓娟，汪求真，郝海波，郭玉妹，蔺瑞函，马爱国

(青岛大学医学院，山东青岛266000)

摘要：目的：探讨大剂量维生素D3补充对糖尿病(DM)大鼠Lee’s指数及胰岛、肌肉细胞组织学的影响。方法：高糖高脂喂养结合注射链脲佐菌素的方法制备DM模型，不同浓度的维生素D3灌胃6w，HE染色观察胰岛和肌肉形态。结果：125倍和200倍维生素D3组大鼠Lee’s指数比DM组明显升高。各维生素D干预组胰岛和骨骼肌组织学形态明显改善。结论：适量维生素D3补充能增加DM大鼠Lee’s指数，恢复异常的胰岛和肌肉形态。

关键词：糖尿病；维生素D3；Lee’s指数；肌肉；胰岛细胞

糖尿病(DM)是一种由于胰岛素分泌和(或)作用缺陷引起的慢性代谢紊乱性疾病，无论在发达国家还是发展中国家，其患病率都有逐年升高的趋势，已成为日益增长的全球性公共卫生问题[1]。研究表明，DM患者除了心脏、肾脏、视网膜等器官组织的损伤外，还可导致各种类型的胰腺和肌肉损伤。DM存在着进行性胰岛β细胞功能恶化和胰岛萎缩，有报道称，DM患者胰岛β细胞功能比正常人降低50%，胰岛细胞数量降低60%[2，3]，说明胰岛功能缺陷在DM的发生发展中发挥着重要作用。DM患者消耗大量脂肪和蛋白质，肌肉组织不能正常利用葡萄糖和有效释放能量，体重和Lee’s指数明显降低，同时机体组织失水和电解质失调，可能还存在着肌肉组织自身的病变，因此对DM患者进行胰岛β细胞功能的干预，恢复体重和肌肉功能可能延缓DM的发生发展，并减少其并发症[4，5]。

维生素D是一种重要的调节钙磷平衡和脂质代谢的激素，维生素D3是其最常见的一种形式[6]。近年来有研究证明，维生素D除了这些常见的功能以外，还具有一些其他的重要功能，如调控胰岛素抵抗和增加体重等。流行病学调查发现，人群中维生素D受体基因的多态性与DM的发生存在一定相关性，且DM患者血清中活性维生素D3水平显著低于正常人群[7]。目前，关于大剂量维生素D3补充对DM患者体重及肌肉和胰岛组织学形态影响的研究鲜有报道。

1材料与方法

1.1实验动物、试剂和仪器

SPF级雄性SD大鼠100只，体重180～220g之间(山东省鲁抗制药公司提供，合格证为soxk 鲁20130001)；胆固醇、胆盐(河南平顶山生物制品公司)；STZ(美国sigma公司)；血糖仪和试纸(Contour TS，日本拜耳保健有限责任公司)；维生素D3(青岛双鲸公司)；显微镜(日本Olympus公司)。

1.2糖尿病大鼠模型制备及维生素D干预

SD大鼠适应性喂养1w后随机分为2组：对照组(12只)和糖尿病造模组(88只)。大鼠饲养在笼中，每笼5～6只，保持度在25℃左右，每天光照12h，自由采食和饮水，每周准确称量大鼠体重。对照组大鼠喂养不含维生素D的基础饲料、造模组大鼠喂养不含维生素D的高糖高脂饲料(含68.5%的基础饲料、20%的蔗糖、10%的猪油、1%的胆固醇及0.5%的胆盐)。喂养4w后，造模组空腹腹腔注射链脲佐菌素(STZ)35 mg/kg体重、对照组空腹注射柠檬酸钠缓冲液35 mg/kg 体重，注射后24h和72h测大鼠空腹血糖，2次空腹血糖均>11.1 mmol/L且大鼠出现明显的多食、多饮、多尿和体重减轻症状为造模成功[8]。在本研究中，88只大鼠中造模成功80只，造模成功率为91%。造模成功后，所有的大鼠均保持与之前相同的饮食。将造模成功的80只大鼠随机分为5组，每组16只。6组大鼠给予不同剂量的维生素D连续灌胃6w，对照组N和糖尿病模型组DM组，给予生理剂量的维生素D(36 IU /kg体重)，5N、25N、125N和200N组分别给予5、25、125、200倍生理剂量的维生素D，剂量分别为180、900、4 500和7 200IU/kg体重。实验结束时，各组大鼠的数量为N组12只、DM组14只、5N组13只、25N组14只、125N组15只、200组15只。

1.3检测指标和方法

1.3.1体重、Lee’s指数及血清25(OH)D大鼠饲养期间，每周准确称量大鼠体重。处死大鼠后，用皮尺量取大鼠的体长，计算Lee’s指数，计算方法为：[体重(g)×103/体长(cm)]1/3。连续灌胃第6w末，清晨空腹经水合氯醛麻醉后处死。经腹主动脉取大鼠全血5mL，离心后取上层血清，血清25(OH)D采用放射免疫法检测。

1.3.2大鼠胰岛及肌肉组织病理切片分离大鼠的胰腺和肌肉置于固定液中，采用HE染色的方法制备大鼠胰腺和肌肉组织切片，显微镜下观察胰腺和肌肉组织学的形态。

1.4统计分析方法

数据分析采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析，数据呈正态分布，用均数±标准差表示，数据两两比较用LSD方法进行，以P<0.05为具有统计学意义。

2结果与分析

2.1DM大鼠造模情况

在本研究中，造模的大鼠共有88只，造模成功的有80只，造模成功率为91%。

2.2维生素D3干预后各组大鼠血清25(OH)D 浓度

维生素D3干预6w后，25N、125N和200N组大鼠血清25(OH)D浓度明显高于N组和DM组(P<0.05)，并呈现明显剂量—效应关系(表1)。

表1　各组大鼠25(OH)D 浓度

注：a与N组相比，P<0.05；b与DM组相比，P<0.05。

2.3维生素D3干预对大鼠体重和Lee’s指数的影响

从第5w注射STZ后DM组大鼠体重较N组明显降低(P<0.05)。用维生素D3灌胃后，与DM组相比，125N组体重有明显的增长(P<0.05)，接近于正常水平，说明每日补充125倍生理剂量的维生素D3可显著增加DM大鼠的体重。大鼠Lee’s指数见表2，DM组大鼠比N组明显降低(P<0.05)，用维生素D3灌胃后，125N和200N组大鼠Lee’s指数明显升高，与DM组相比，差异统计学意义(P<0.05)，其中，125N组接近于正常水平。

表2　各组大鼠Lee′s指数

注：a与N组相比，P<0.05；b与DM组相比，P<0.05。

2.4各组大鼠胰岛及肌肉组织学形态

图1中N组大鼠的胰腺组织染色(×200)显示，正常组胰岛细胞成团索状分布，形态正常，胞浆丰富，染色淡，细胞核清晰可见，呈圆形，位于中央。DM组大鼠胰岛细胞明显减少，体积减小，失去正常形态，核溶解或固缩，细胞营养不良或肿胀。5N、25N、125N和200N组大鼠胰岛细胞体积比DM组增大，胰岛细胞数目增多，细胞形态比DM组明显好转，其中，5N、25N、125N组更明显。

图2显示，N组大鼠肌肉组织HE染色(×200)肌纤维饱满，平行排列呈束状，可见明暗相间的条纹，肌浆均匀，细胞核排列整齐。DM组大鼠肌纤维束明显变窄薄弱，间隔变大，肌浆不均匀，细胞核排列紊乱，肌细胞萎缩变小，细胞间隙变大，显示肌肉萎缩。经维生素D3干预后，与DM组相比，5N、25N、125N和200N组大鼠肌纤维束变厚，间隙变窄，肌细胞明显增大，说明VD3干预能缓解DM大鼠肌肉萎缩的状况。

3讨论

本研究发现，适量的维生素D3补充能够增加DM大鼠体重，并对DM大鼠异常的肌肉和胰岛组织学形态起到改善作用。尽管国内外已有一些有关维生素D补充对DM影响的报道，但其对DM影响的剂量-效应关系的研究很少，因此很难确定维生素D对DM的最佳作用剂量。Hyoung-Jun 等[9]研究发现，连续12w摄入维生素D 1 200 IU/d，对2型DM老年女性的去脂体重没有显著影响，而Robin M 等[10]研究发现，每日摄入维生素D增加到2 000IU时，可以改善老年2型DM患者对血糖的控制，改善身体成分并增强心血管健康，这说明低剂量的维生素D补充对DM患者或维生素D缺乏的患者作用不大，维生素D只有在高剂量时才能对DM患者发挥作用。因而在本研究中，生理剂量的维生素D(36IU/kg 体重)用于N组和DM组，5倍生理剂量的维生素D用于5N组，此剂量也是维生素D的可耐受最高摄入量(UL，成年人为 2 000IU/d、大鼠为180IU/d/kg体重)，其他剂量分别为25倍(900IU/kg体重)、125倍(4 500IU/kg体重)和200倍(7 200 IU/kg体重)[11]。

维生素D进入机体后，在肝脏中转化为25(OH)D，在肾脏进一步羟化成为维生素D的活化形式1，25(OH)2D3。由于25(OH)D在血中含量相对较高，半衰期长，较1，25(OH)2D3更稳定，因此目前临床上普遍通过测定血中25(OH)D的水平来反映机体维生素D储备情况。Lee’s指数是目前在评价成年大鼠肥胖程度方面的有效指数。有研究表明，维生素D可以调节能量代谢[12]。本研究发现，连续6w每天摄入125倍和维生素D可以增加DM大鼠的体重和Lee’s指数，并使其接近正常大鼠水平，连续6w每天摄入200倍维生素D也可以增加大鼠的Lee’s指数。研究发现，维生素D可以通过作用于呼吸链能量代谢相关的蛋白质，影响细胞能量代谢，纠正高糖负荷造成的细胞能量代谢紊乱，继而使细胞发挥正常功能[13]。

图1　各组大鼠胰岛组织学形态

图2　各组大鼠的肌肉组织学形态

本研究发现，在病理学上，DM模型组大鼠肌肉和胰腺组织损伤加重，明显大于正常对照N组。大剂量的维生素D3干预下大鼠肌肉和胰腺组织，其损伤都明显小于DM模型组，说明维生素D3对DM大鼠的肌肉和胰腺具有保护作用。DM患者常会有“糖尿病肌病”，即表现为四肢软弱无力，肌肉酸痛等症状，严重者甚至出现肌肉萎缩，可能是由于周围神经病变、代谢障碍和微血管病变等所致的一系列复杂的病理过程。Curry等[14]研究发现，维生素D严重缺乏的兔肌肉中肌质网内ATP-依赖的Ca2+摄取孤立小泡比VD充足的兔明显减少，在预先补充维生素D后，该结果被逆转。1，25(OH)2D3可以通过Ca-ATPase向内质网内转运Ca2+，在维生素D缺乏的动物中，肌细胞内重要的收缩蛋白肌动蛋白和肌钙蛋白C的水平降低，给予维生素D治疗后上述蛋白的表达量恢复正常，由此可见，维生素D可以改善异常的肌肉形态。胰岛素(INS)主要由胰岛β细胞分泌，能提高肝脏和肌肉组织摄入葡萄糖(GLU)，促进GLU进入肌肉组织细胞内。在INS缺乏的时候，进入组织的GLU减少，肝糖原的分解和异生增强，由肝脏释放入血的GLU增加，血糖水平升高，超过肾糖阈会从尿中排除，表现为DM[15]。大量临床观察发现，DM发病是一个长期的胰岛β细胞慢性损伤与凋亡过程[16]。临床流行病学调查和细胞层次的实验研究发现，DM患者口服维生素D3有助于保护胰岛β细胞的功能，减少急性高糖刺激引起的β细胞的损伤，改善DM并发症[17]。郭丽萍[18]等研究发现，维生素D3可通过调控细胞内外钙离子浓度影响胰岛细胞中的INS表达分泌情况。INS的分泌依赖于β细胞内外钙离子浓度及β细胞内钙信号通路的活化，而活性维生素D3对于钙信号通路的激活意义重大。

在本研究中，我们应用了从生理剂量到200倍生理剂量较大范围内的不同水平维生素D补充，国内外尚未见类似报道，同时，在造模时我们得到了一个高达91%的成模率，但是此研究是针对大鼠的，其研究结果不能直接推及到人。本研究为大剂量维生素D3干预对能量代谢及肌肉和胰腺组织的影响提供了重要的科学依据，其机制有待进一步的深入研究。◇

参考文献

[1]Korkmaz-Icoz S，Lehner A，Li S，et al.Mild Type 2 Diabetes Mellitus Reduces the Susceptibility of the Heart to Ischemia/Reperfusion Injury：Identification of Underlying Gene Expression Changes[J].J Diabetes Res，2015，2015(396414).

[2]Wajchenberg BL.beta-cell failure in diabetes and preservation by clinical treatment[J].Endocr Rev，2007，28(2)：187-218.

[3]Park S，et al.Exercise improves glucose homeostasis that has been impaired by a high-fat diet by potentiating pancreatic beta-cell function and mass through IRS2 in diabetic rats[J].J Appl Physiol ，2007，103(5)：1764-1771.

[4]Schrauwen-Hinderling VB，et al.Muscular mitochondrial dysfunction and type 2 diabetes mellitus[J].Curr Opin Clin Nutr Metab Care，2007，10(6)：698-703.

[5]Jacobs-Kosmin D，Dehoratius RJ.Musculoskeletal manifestations of endocrine disorders[J].Curr Opin Rheumatol，2005，17(1)：64-69.

[6]李敏，等.维生素D3补充对大鼠免疫细胞功能影响的实验研究[J].中国食物与营养，2012，18(3)：64-67.

[7]Judd SE，Tangpricha V.Vitamin D deficiency and risk for cardiovascular disease[J].Am J Med Sci，2009，338(1)：40-44.

[8]Ti Y，Xie GL，Wang ZH，et al.TRB3 gene silencing alleviates diabetic cardiomyopathy in a type 2 diabetic rat model[J].Diabetes，2011，60(11)：2963-2974.

[9]Kim HJ，Kang CK，Park H，et al.Effects of vitamin D supplementation and circuit training on indices of obesity and insulin resistance in T2D and vitamin D deficient elderly women[J].J Exerc Nutrition Biochem，2014，18(3)：249-257.

[10]Daly RM，Miller EG，Dunstan DW，et al.The effects of progressive resistance training combined with a whey-protein drink and vitamin D supplementation on glycaemic control，body composition and cardiometabolic risk factors in older adults with type 2 diabetes：study protocol for a randomized controlled trial[J].Trials，2014，15(431).

[11]程义勇.中国居民膳食营养素参考摄入量2013修订版简介[J].营养学报，2014，36(4)：313-317.

[12]Balvers MG，Brouwer-Brolsma EM，Endenburg S，et al.Recommended intakes of vitamin D to optimise health，associated circulating 25-hydroxyvitamin D concentrations，and dosing regimens to treat deficiency：workshop report and overview of current literature[J].J Nutr Sci，2015，4(e23).

[13]孙双玲，等.维生素D3干预高糖负荷U937细胞的差异蛋白质组分析[J].卫生研究，2014，43(3)：366-371.

[14]Curry OB，Basten JF，Francis MJ，et al.Calcium uptake by sarcoplasmic reticulum of muscle from vitamin D-deficient rabbits[J].Nature，1974，249(452)：83-84.

[15]Leung PS.The physiology of a local renin-angiotensin system in the pancreas[J].J Physiol，2007，580(Pt 1)：31-37.

[16]Grossman EJ，Lee DD，Tao J，et al.Glycemic control promotes pancreatic beta-cell regeneration in streptozotocin-induced diabetic mice[J].PLoS One，2010，5(1)：e8749.

[17]Friedrichs K，et al.Fibrosis in Atrial Fibrillation-Role of Reactive Species and MPO[J].Front Physiol，2012，3(214).

[18]郭丽萍.活性维生素D3对糖尿病大鼠胰岛β细胞功能影响的研究[J].中国医药导报，2013，10(12)：27-29、32.

(责任编辑李婷婷)

基金项目：国家自然科学基金(项目编号：81472983)。

作者简介：窦晓娟(1989—)，女，硕士，研究方向：营养流行病学。

通讯作者：汪求真(1971—)，女，博士，硕士生导师，研究方向：营养流行病学。

Influence of High Dosage of Vitamin D3Supplementation on Islet and Muscle Histology Morphology in Diabetic Rats

DOU Xiao-juan，WANG Qiu-zhen，HAO Hai-bo，GUO Yu-mei，LIN Rui-han，MA Ai-guo

(College of Public Health，Qingdao University，Qingdao 266000，China)

Abstract：ObjectiveTo discuss the influence of high dosage of vitamin D3supplementation on Lee’s index， islet，and muscle histology form in diabetic rats.MethodWe established diabetic rats models by intraperitoneally injection streptozocin based on high-fat diet.The rats were divided into 6 groups and supplemented with four different high doses of vitamin D3 for 6 weeks，islet muscles morphology were observed by HE staining.ResultTotally 125 times vitamin D3 supplementation could increase the Lee’s index of diabetic rats when compared with DM group.Islet and muscles morphology were obviously improved in vitamin D3 supplementation group.ConclusionModerate vitamin D3 supplementation could increase the weight of diabetic rats and recover abnormal morphology of islet and muscles.

Keywords：diabetes mellitus(DM)；vitamin D3；Lee’s index；muscle；islet