大豆根瘤菌AWCS13-4菌株培养条件的筛选与优化

李正鹏，何庆元，史　钧，祝嫦巍，吴　萍

(安徽科技学院　应用微生物研究所, 安徽　凤阳　233100)



大豆根瘤菌AWCS13-4菌株培养条件的筛选与优化

李正鹏，何庆元，史钧，祝嫦巍，吴萍*

(安徽科技学院应用微生物研究所, 安徽凤阳233100)

摘要：研究了大豆根瘤菌AWCS13-4 菌株在YMA、TY、PA 、BSE 4种培养基中的生长情况，并通过单因素和正交试验确定最佳培养条件。结果表明，AWCS13-4菌株在YMA培养基中生长较好，蔗糖为最佳碳源，酵母粉为最佳氮源，最佳pH为7.0，最佳接种量为3%，最佳培养温度为30℃。在单因素的基础上，采用正交试验，对4个因素进行优化，其最佳培养组合为：每升培养基中添加蔗糖10 g，酵母粉3 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO4 0.5 g，NaCl 0.1 g，CaCl2·5H2O 0.05 g，Rh微量元素液4 mL；pH为7.0，接种量为3%，培养温度为30℃。

关键词：大豆根瘤菌；培养基；条件优化；正交试验

大豆根瘤菌是革兰氏阴性细菌，广泛的分布于土壤中，它能侵染豆科植物根部或者茎部，然后在植物根部或者茎部分化形成类菌体，将空气中的氮素同化为植物可吸收的氨[1-3]，根瘤菌与豆科植物共生固氮体系是自然界固氮效率最高，固氮量最多的生物固氮体系[4]。

随着人类社会的发展，生活需求日益增加，对谷物的需求也增大，谷物作物对氮肥的需求量也增加，增加氮肥的工业生产与更好的利用和提高生物固氮能力是农业提供氮肥的两条重要途径[5]，特别是在我国人口暴增和节约资源的前提下，我们应该大力发展生物固氮技术。大豆与根瘤菌的共生固氮作用既能直接改善大豆的氮素营养状况、提高大豆的产量和品质，又能将更多的固定氮素释放到土壤中，从而起到培肥地力的作用，对于可持续农业的发展有着非常重要的作用及生态效果[6-7]。目前，接种根瘤菌剂已经成为世界各国豆科作物增产、减少化肥施用的一项技术措施，在许多国家都有大规模商品菌剂的生产和出售，应用面积也不断扩大[8-13]。因此，开发一类高效的大豆固氮菌剂对提高大豆的产量，增加土壤肥力具有重要意义。虽然大豆根瘤菌菌剂使用表现出良好的应用前景，受到越来越多的关注，但是我国大豆根瘤菌剂的研发与应用时间相对较短，很多产品的研发还是处于研究阶段。因此，要想使我国在大豆根瘤菌剂的应用方面再上一个新台阶，必须加大研发力度。本文希望通过科学的试验设计与分析，得出不同的因素对根瘤菌AWCS13-4的影响，得到活菌数较高、生长速度较快，适合实际应用的最佳培养条件，为根瘤菌剂的生产提供依据。

1材料与方法

1.1试验材料

菌种 大豆根瘤菌AWCS13-4菌株(安徽科技学院生物技术实验室提供)。

1.2培养基

YMA培养基[14]，其主要构成为：甘露醇10 g，酵母粉1 g， K2HPO40.5 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·5H2O 0.05 g，Rh微量元素液4 mL，H2O1000 mL，pH6.8～7.0。TY培养基：胰蛋白胨5 g，酵母粉3 g，CaCl21.3 g，H2O 1000 mL，pH 6.8～7.0。PA培养基：蛋白胨2 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，H2O1000 mL，pH 6.8～7.0。BSE培养基[15]：甘露醇10 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO40.5 g，NaCl 0.1 g，CaCl2·5H2O 0.1 g，Rh微量元素液4mL，豆芽汁1000 mL，pH 6.8～7.0。斜面培养基：YMA 固体培养基(YMA 液体培养基+2%琼脂粉)。种子培养基：用YMA 培养基作为种子培养基。

1.3试验方法

1.3.1菌种活化在无菌条件下将AWCS13-4菌种接种于固体斜面培养基(YMA)上，在温度为28℃的条件下培养3 d。

1.3.2种子液制备将已经活化好的AWCS13-4根瘤菌接一环到YMA液体培养基(250 mL的三角瓶装80 mL培养基)中，在28 ℃、150 r/min转速的摇床中震荡培养，3d后即得种子液备用。

1.3.3菌株在YMA、TY、PA、BSE 4种液体培养基中不同时期生长状况的测定将培养好的种子液，按照3%(V∕V)接种量接入YMA、TY、PA、BSE 4种液体培养基(250 mL的三角瓶装100mL培养液)中，28 ℃、150 r/min转速的摇床中震荡培养，分别在0、24、48、72 h时测定OD620nm[11]值。

1.3.4培养基碳源的筛选从4种培养基中选择最适合AWCS13-4根瘤菌生长的一种培养基，进行碳源的利用试验，分别用10 g的葡萄糖、甘露醇、麦芽糖、乳糖、蔗糖及甘油进行试验，培养基中其他成分不变。按3%接种量将种子液接入上述培养基中，于28 ℃、150 r/min转速的摇床中震荡培养，在0、24、48、72 h时测定OD620nm值。

1.3.5培养基氮源的筛选确定最佳碳源后，在培养基中放入1 g不同的氮源酵母粉、蛋白胨、大豆粉、玉米粉及麦麸进行试验，培养基其他成分不变。按3%接种量将种子液接入上述培养基中，于28 ℃、150 r/min转速的摇床中震荡培养，在0、24、48、72 h时测定OD620nm值。

1.3.6培养基初始pH值的筛选确定最佳碳、氮源后，将培养基中的初始pH值设定为4、5、6、7、8、9进行试验，培养基中其他成分不变。按3%接种量将种子液接入上述培养基中，于28 ℃、150 r/min转速的摇床中震荡培养，在0、24、48、72 h时测定OD620nm值。

1.3.7接种量的筛选确定最佳碳、氮源、pH值后，将接种量设定为1%、2%、3%、4%、5% 进行试验，培养基其他成分不变。于28 ℃、150 r/min转速的摇床中震荡培养，在0 h、24 h、48 h、72 h时测定OD620nm值。

1.3.8培养温度的筛选确定最佳碳、氮源、pH值和接种量后，将培养温度设定为20、25、30、35、40 ℃进行试验，培养基其他调节不变。按3%接种量将种子液接入上述培养基，于150 r/min转速的摇床中震荡培养，在0、24、48、72 h 时测定OD620nm值。

1.3.9正交试验设计在单因素试验的基础上，采用L9(34)正交试验法[16]对碳源、氮源添加量、pH值、温度4个影响菌体生长的因素进行优化。因素水平表见表1。

表1　因素水平表

2结果与分析

2.1AWCS13-4菌株在4种培养基上的生长情况

由图1可见AWCS13-4菌株在YMA、TY、PA、BSE 4种培养基中不同时期的OD620nm值的变化情况。试验结果表明：AWCS13-4菌株在YMA培养基和BSE培养基中生长速度比较快，其次是TY培养基，在PA培养基中生长速度最慢，同时YMA培养基营养物质全面，原材料比较易于得到，因此本试验的最佳培养基为YMA培养基，选定YMA培养基进行剩余条件优化。

图1　AWCS13-4菌株在4种培养基上的生长状况

2.2AWCS13-4菌株对不同碳源的利用

碳源为微生物细胞提供能量物质和碳架，对微生物的生长发育起着至关重要的作用，因此，碳源的选择对微生物的培养特别重要。从图2可以看出：AWCS13-4菌株在以蔗糖或者甘露醇为碳源的培养基中生长状况较好，生长速度较快，且蔗糖稍强于甘露醇，培养72h后，蔗糖和甘露醇的OD620nm值最高可分别达到1.311和1.300。在葡萄糖和麦芽糖为碳源的培养基中生长速度较缓，经过72h的培养，葡萄糖和麦芽糖的OD620nm值最高分别达到了1.065和1.055，在以乳糖和甘油为碳源的培养基中根瘤菌AWCS13-4的生长速度最差。故此，实验室提供的六种不同碳源对AWCS13-4菌株生长情况的影响依次为：蔗糖>甘露醇>麦芽糖>葡萄糖>乳糖>甘油。并且蔗糖的生产成本远低于甘露醇的生产成本，蔗糖比较廉价易得，故此本试验的最佳培养基碳源为蔗糖。

图2　AWCS13-4菌株对不同碳源的利用状况

2.3AWCS13-4菌株对不同氮源的利用

氮源的主要作用是构建菌体细胞物质和菌体中的含氮代谢物这两个方面，是菌体不可缺少重要营养元素之一。试验结果表明(图3)： AWCS13-4 菌株以酵母粉为氮源，其生长速度最快，经过72 h后OD620nm值最高可达到1.469。在以蛋白胨和大豆粉为氮源的培养基中，根瘤菌AWCS13-4生长速度较缓，经过72 h后，其OD620nm值最高分别达到1.114和0.932，根瘤菌AWCS13-4在以玉米粉和麦麸作为氮源的培养基中生长较差。故此本试验的最佳培养基氮源为酵母粉。

图3　AWCS13-4菌株对不同氮源的利用状况

2.4不同pH值对AWCS13-4菌株生长的影响

图4　不同pH值对AWCS13-4菌株生长的影响

适宜的pH可以促进根瘤菌AWCS13-4的生长，强酸强碱都不利于根瘤菌的生长，试验结果表明(图4)：AWCS13-4菌株在pH为7时生长速度最好，经过72 h的培养，pH为7的OD620nm值最高达到1.423，在pH为4、5、9时，根瘤菌AWCS13-4的生长速度较为缓慢，根瘤菌AWCS13-4在不同pH值中的生长状况排序依次为：pH 7>pH 8>pH 6>pH 9>pH 5>pH 4，所以本试验培养基中最适pH值为7。

2.5不同接种量对AWCS13-4菌株生长的影响

图5　不同接种量对AWCS13-4菌株生长的影响

适宜的接种量有利于根瘤菌充分利用培养基中的营养，使得根瘤菌可以快速生长，但是接种量过大时，由于对营养的竞争吸收，反而不利于根瘤菌的培养。故此，筛选出适宜的接种量对根瘤菌的培养有着重要的作用。试验结果表明(图5)：AWCS13-4菌株在接种量为3%(250 mL的三角瓶中装100 mL的种子液)的培养基中生长状况最好，且最终OD620nm值可达到1.435，故此，本次试验中最好接种量为3%。

2.6不同培养温度对WCS13-4菌株生长的影响

不同的根瘤菌都有着适宜自己快速生长的温度，温度过高或过低都不利于菌株的生长，甚至导致菌株的死亡，故此筛选适宜根瘤菌最适的培养温度是至关重要。试验结果表明(图6)：AWCS13-4菌株在培养温度为30 ℃时生长速度最快，生长72 h后，其OD620nm值最高达到了1.474。在温度为25 ℃和35 ℃时，生长72 h，其OD620nm值最高可分别达到1.347和1.239，在温度为20 ℃和40 ℃时，根瘤菌AWCS13-4的生长状况较差，不同培养温度的最终生长结果顺序依次为：30 ℃>25 ℃>35 ℃>20 ℃>40 ℃。故此本试验最佳培养温度为30 ℃。

图6 不同培养温度对WCS13-4菌株生长的影响

2.7最佳培养条件的正交优化

由表2可以看出，在9个处理中，培养3 d后测吸光值，AWCS13-4 菌株在9号培养基上生长状况最好。经极差分析，4种主要因素对其生长速度影响的顺序依次为：温度(D)>pH值(C)>酵母粉(B)>蔗糖(A)；其中温度为主要因素。正交分析最佳组合为A2B3C2D2，即培养基的碳源为蔗糖10 g，最佳氮源为酵母粉3 g，最佳pH值为7，最佳温度为30 ℃。

表2　正交试验结果

3结论与讨论

本试验通过对4种培养基的筛选，得出的结果是AWCS13-4菌株在YMA培养基上生长的较好，YMA培养基是根瘤菌的常规培养基，大多数的根瘤菌都能在YMA培养基上生长[17]，此外，根瘤菌AWCS13-4菌株在BSE培养基中生长仅次于YMA培养基，但由于在制备豆芽汁的过程中有很多因素是难以控制的，比如豆芽汁原料的不稳定性等[18]，因此本试验选择YMA液体培养基作为大豆根瘤菌AWCS13-4最佳培养基。

试验得到的最佳碳源为蔗糖和甘露醇，但是由于甘露醇价格高，蔗糖价格低廉且易获得，故此选择蔗糖为最佳碳源。对根瘤菌AWCS13-4菌株的其余的培养条件如氮源、pH、接种量、温度进行筛选，同时通过正交试验，筛选出适宜根瘤菌AWCS13-4菌株生长的最佳氮源为酵母粉3g，最佳培养温度为30 ℃，最适宜pH为7，最优接种量为3%。用以上条件来培养AWCS13-4菌株，可促进大豆根瘤菌的良好生长。

大豆根瘤菌培养条件的筛选和优化有众多的好处，如可以降低生产成本，实现资源的高效利用，还可以实现大豆根瘤菌快速、大量的生长，同时通过正交试验所得出的结果，为农业生产和工业化生产根瘤菌菌剂提供了理论依据，但本次试验所用的培养基为液体培养基，液态培养基具有保质期短，运输不方便等缺点，如何促使液体培养基活菌数高，保质期长，易运输，易配制还需要进一步的研究。

通过本试验得出最佳培养基是YMA培养基，以此培养基为基础进行正交设计试验，得出的最佳培养条件为：蔗糖10 g，酵母粉3 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO40.5 g，NaCl 0.1 g，CaCl2·5H2O 0.05 g，Rh微量元素液4 mL，H2O 1000 mL，pH是7.0，接种量为3%，培养温度为30 ℃。

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(责任编辑：马世堂)

收稿日期：2016-01-08

基金项目：国家星火计划(2015GA710012)，安徽省教育厅自然科学基金项目(KJ2011Z066)，安徽省教育厅自然科学基金项目 (KJ2013A077)，安徽科技学院自然科学基金项目(ZRC2013367)。

作者简介：李正鹏(1971-)，男，安徽省天长市人，硕士，副教授，主要从事微生物学教学与研究。*通信作者：吴萍，教授，E-mail：wupinggu@126.com。

中图分类号：S656.1

文献标识码：A

文章编号：1673-8772(2016)03-0014-06

Screening and Optimizing of the Culture Conditions for Soybean Rhizobium Strain AWCS13-4

LI Zheng-peng, HE Qing-yuan, SHI Jun, ZHU Chang-wei ,WU Ping*

(Institute for Applied Microbiology, Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，China)

Abstract：The growth conditions of AWCS13-4 were studied using single factor and orthogonal test in 4 culture medium of YMA, TY, PA and BSE. The results showed that AWCS13-4 grew better in culture medium of YMA than in others. The best carbon source, nitrogen source, pH value, inoculation amount and temperature were saccharose, yeast powder, pH 7.0, 3% and 30℃ respectively. On the basis of single factor, orthogonal experiment was used to optimize the 4 factors. The best culture conditions were 10 g saccharose, 0.2 g MgSO4·7H2O，0.5 g K2HPO4 ，0.1 g NaCl，0.05 g CaCl2·5H2O, 4 mL Rh microelement solution in 1 L culture medium, pH 7.0, inoculation amount of 3% and culture temperature of 30℃.

Key words:Soybean rhizobia;Medium;Condition optimization;Orthogonal experiment