抗菌肽作用机制及应用研究进展

刘世财，范琳琳，郑珩，张秋怡

(中国药科大学 生命科学与技术学院，江苏 南京 210009)

抗菌肽作用机制及应用研究进展

刘世财，范琳琳，郑珩Δ，张秋怡

(中国药科大学 生命科学与技术学院，江苏 南京 210009)

在这抗生素耐药性病菌不断出现的时代，新型抗菌药物的发现已迫在眉睫。而抗菌肽为大多数生物对入侵病原体的自然防御系统的重要组成部分，具有独特的抗菌作用机制，迅速杀菌且不易引发细菌的耐药性，可单独或与抗生素联合使用杀伤病原体，是一类极具发展潜力的生物药物。本文根据抗菌肽的理化性质，作用机制及抗菌肽的设计等进行综述，并对几种有前景的抗菌肽作一简单介绍。

抗生素耐药性；抗菌肽；作用机制；抗菌肽设计；应用进展

自1928年Fleming发现青霉素以来[1]，人们逐渐进入控制和治疗细菌感染性疾病的时代。然而大量广谱抗生素的使用加速了致病菌的进化，使得近些年大量耐药细菌及多重耐药细菌不断出现。由于新型抗生素的研发并没有伴随着抗药性细菌的增加而增加，而且西方很多制药公司由于抗生素的经济效益不大，且报批挑战性大，陆续退出了抗生素药物的研发，从而导致近几十年来新批准的抗生素药物的数量在不断的减少，新抗生素的研发甚至出现了空白[2-4]。耐药细菌及多重耐药细菌的存在与抗生素的缺乏使得新型抗菌药物的发现已迫在眉睫。

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)为大多数生物对入侵病原体的自然防御系统的重要组成部分，其具有独特的抗菌作用机制，迅速杀菌作用且不易引发细菌的耐药性，可单独或与抗生素联合使用杀伤病原体。传统的抗生素通常是针对单一的酶来控制代谢途径(例如脱氧核糖核酸、蛋白质及细胞壁的合成)，容易引起细菌的耐药性[5]。与传统抗生素相比，大部分的抗菌肽显示出了多种生物活性，主要通过影响细胞质膜来发挥作用[6]。因此，细菌必须要改变它们膜的组成和结构来对抗菌肽产生抗药性，但这对菌体本身也会造成严重的伤害。细菌细胞膜外层富含阴离子磷脂，哺乳动物细胞膜的两性离子脂质比较丰富，这正是抗菌肽可以抗菌而对哺乳类细胞不造成损坏的主要原因。而且已有研究表示抗菌肽具有免疫调节的功能，比如趋药性、伤口愈合、抗内毒素等[5]。所以抗菌肽是一类极具发展潜力的生物药物。本文就抗菌肽的理化性质，作用机制及抗菌肽的设计等进行综述，并对几种有前景的抗菌肽作一简单介绍。

1 抗菌肽理化性质及作用机制

抗菌肽是一类有生物学活性的小分子多肽，通常是由12 ～ 60个氨基酸组成。富含赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸，并且含有高于30%的疏水性氨基酸。抗菌肽大多为两亲性且带有一定量的正电荷，通常是+2～+ 9，为阳离子多肽。根据NMR测定的三维结构可以把抗菌肽肽分为5大类：①α螺旋结构的抗菌肽，有许多的结构和生化研究都集中在蛾血素上；②富含半胱氨酸的抗菌肽，比如人类中性粒细胞肽HNP-1,HNP-2和HNP-3；③β折叠结构的抗菌肽；④富含组蛋白、精氨酸和脯氨酸的抗菌肽；⑤含有稀有的氨基酸和修饰过的抗菌肽。

深入了解抗菌肽杀死细菌的作用机制有利于抗菌肽药物的设计。几十年的深入研究，人们提出了多种理论假设解释抗菌肽抑制或者杀灭微生物过程。但是，抗菌肽抗菌机制研究只针对了个别几种抗菌肽，所以目前还没有一个能够涵盖所有种类抗菌肽作用机理的假说，而且也不确定哪种假说更接近真实情况[7]。常见的抗菌肽作用机制有以下几种。

1.1 桶板模型(barrel-stave model) 抗菌肽通过静电作用和菌膜磷脂双分子层相结合并且相互聚合，使得菌膜构象发生改变，并以多聚体的形式从垂直于细胞膜的方向插入到细胞膜磷脂双分子层中。多聚体中的肽分子在细胞膜上呈束状排列，疏水面向外朝向细胞膜的酰基链，亲水面朝内形成孔隙或通道，从而形成横跨细胞膜的离子通道。这个孔隙的形成通过测量通道中电导率逐步的增加得到证实。

1.2 毯式模型(carpet model) 这个模型首次用来描述了皮抑菌肽(dermaseptin)的作用[8]。在这个模型中，抗菌肽就像一张“毯子”平铺于菌膜的表面，当抗菌肽达到一定的溶度时，菌膜表面会形成小孔导致膜的损坏，细胞内容物外渗，造成菌体的死亡。抗菌肽不用插入到菌膜的疏水核心，也不用和亲水表面组装在一起。该模型作用机制步骤：①抗菌肽单体优先和磷脂基团相结合；②抗菌肽单体在菌膜表面依次排列，膜亲水表面由于磷脂基团和肽的结合和水的作用取向发生改变在膜上形成疏水核；③抗菌肽裂解菌膜导致菌体的死亡[9]。

1.3 环形孔模型(toroidal pore model) 抗菌肽带正电荷，而菌膜表面带负电荷，在静电吸引的作用下它们相结合，结合后抗菌肽的疏水基极性头部的移位可使细胞膜疏水中心形成裂口，造成菌膜正向弯曲拉伸，菌膜的裂口拉伸进一步破环了菌膜的完整性。Yoneyama等[10]第一次提出的环形孔模型，在Yoneyama的研究中发现乳酸乳球菌素(lacticin Q)能使革兰阳性菌细胞膜上形成环形孔从而杀死细菌。Lacticin Q可以快速地作用在细菌外膜，形成至少4.6nm的孔道从而导致细小蛋白质外。

1.4 凝聚模型(aggregate model) 在这个模型中，抗菌肽与菌膜表面结合后插入，利用自身结构改变和菌膜脂质分子形成类似胶状复合物。然后，这个复合物聚集在一起，通过肽—脂质分子凝聚物的形式跨越菌膜，从而形成了动态的孔道。凝聚模型与环形孔模型相比较，后者中的抗菌肽无特定取向。

1.5 其他作用机制 抗菌肽与菌膜的相互作用的机制除了以上几种模型，此外，有研究表明，抗菌肽还可以和细胞内容物相互作用，和细胞内的DNA、RNA、蛋白质相结合，从而抑制甚至杀死菌体[11]。Shai等[12]从牛精液中分离得到的精液纤维蛋白溶酶在细菌细胞内通过激活一些分子引起细菌的自溶。多肽pp-39和apidaecin已被证明可以通过一种非裂解机制杀死细菌。它们能够抑制蛋白质的合成，及诱导核酸复制所需蛋白质的降解。虽然bac-5和bac-7与pp-39的氨基酸组成相似，但它们的其作用机制是不同的，bac-5和bac-7是通过干扰物质运输和细胞能量代谢来发挥作用的。抗菌肽凝血酶诱导的血小板杀菌蛋白-1和人类嗜中性粒细胞防卫素-1已被证明能够影响细胞膜结构和功能，它们对蛋白质和DNA的合成也具有抑制的作用[13]。来自人乳铁蛋白的九个氨基酸的肽LF11-322(PFR肽,序列为PFWRIRIRR-NH2)对细菌具有强大的杀伤作用， Lu等[14]发现PFR肽对白血病细胞具有抗肿瘤活性，它对胞内的蛋白质和DNA发生影响而产生作用。

2 抗菌肽设计研究策略

虽然目前还没有一个能够涵盖所有种类抗菌肽作用机理的假说，而且也不确定哪种假说更接近真实情况[15]。抗菌肽之间的长度和二级结构也不太一样。但是，大部分的理论认为抗菌肽的生物活性与它所具有的阳离子性和两亲性有着密切的关系。前者决定了抗菌肽的选择性，使其可与表面带负电荷的菌膜发生静电吸引产生相互作用[16]。疏水性氨基酸残基使得抗菌肽能够有效的渗透到菌膜脂质双分子层的内部，从而形成了疏水通道，导致菌膜完整性的破坏，造成菌膜裂解，菌体死亡。所以目前对抗菌肽设计的研究策略主要有以下2点：

① 以天然抗菌肽构效关系为基础，通过C末端酰胺化、对肽序列1个或多个位置上的氨基酸进行替换、缩短肽链的长度、将不同序列的抗菌肽进行片段组合形成杂合肽及抗菌肽骨架环化或分子内侧链环化等方式，设计出一系列抗菌肽的类似物，筛选具有更高活性、安全的抗菌肽。

② 对一系列具有α-螺旋结构的天然抗菌序列进行分析，序列修饰，改变其α-螺旋结构域、带的正电荷量、肽链长度、肽链的两亲性质，然后设计出新的序列模型，进而筛选出抗菌谱更广及活性更高的抗菌肽。

IsCT是从掘地蝎中分离得到的一种抗菌肽，Lee等[17]通过对IsCT氨基酸序列(ILGKIWEGIKSLF-NH2)进行分子改造，替换氨基酸，合成了5个IsCT的类似物，研究中三维结构分析表明了类似物[K7，P8，K11]-IsCT的中间有一个弯折，而且具有最强的抗菌活性及没有溶血活性，这说明IsCT的选择性与脯氨酸引起的弯折有着重要的关系。色氨酸荧光显示(Tryptophan fluorescence)[K7，P8，K11]-IsCT对细菌高选择性及其对富含阴离子的磷脂类膜的高度选择性有着密切的关系。

Lv等[18]对由36个氨基酸组成的PMAP-36抗菌肽进行设计合成，把C端的12个氨基酸残基片段截掉，剩下的N端的24个氨基酸组成了GI24(GRFRRLRKKTRKRLKKIGKVLKWI-NH2)，GI24的活性和PMAP-36基本一致，由此可以说明剩下的24个氨基酸是PMAP-36的活性区域。GI24生物活性高且它的细胞溶血性要比蜂毒肽要低得多。通过定点突变研究表明，GI24的23位高疏水性氨基酸的存在对其抗菌活性具有至关重要的作用。膜通透性和流式细胞仪提供的证据表明，GI24是通过渗透菌膜，破坏膜的完整性，从而杀死菌体细胞。通过扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)可以看到GI24可以使菌体细胞形态学发生很大变化和膜穿孔。

Panteleev等[19-20]利用β-hairpin结构的抗菌肽arenicin-1(RWCVYAYVRVRGVLVRYRRCW)作为模板通过缩短肽链、氨基酸替换和二硫键的引入设计了6个含有17个氨基酸残基的arenicin-1类似物ALP，这些类似物的生物活性和细胞选择性都得到了提高。其中改造后的ALP1(RWCVYARVRGVRYRRCW)具有很强的双重抗菌活性，不影响哺乳动物细胞生存能力的浓度为50 μM。ALP1对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌治疗指数相比于arenicin-1得到了显著的提高。但对细胞膜的选择性降低了一些。通过圆形二色性光谱发现，类似物ALP的二级结构在水环境中类似于arenicin-1，但在模拟的细胞膜(membrane-mimicking)环境中却有明显不同。这项工作表明，β-hairpin抗菌肽的链长对其细胞的选择性影响很大。

3 几种有前景的抗菌肽

近年来，多肽药物在疾病治疗中越来越受到重视，美国FDA在过去的几年间批准了10余种多肽类药物(见表1)。同时，细菌耐药性的发展，也促使人们寻找与常用抗生素具有不同母核的新型抗菌药物。抗菌肽具有与常用抗生素不同的作用靶点和作用机制，对耐药菌有很好的抑菌效果，受到了广泛的关注。目前发现的抗菌肽已超过2500余种[11]，有一些已进入临床试验阶段，如培西加南、奥米加南。还有一些抗菌肽在临床前研究中显示了较好的疗效，副作用较低，具有很好的开发前景，如菌丝霉素、抗菌肽MU1140等，以下对做一些简单的介绍。见表2。

表1 2010-2014年间美国FDA批准的多肽类药物

表2 处于临床前或临床阶段的抗菌肽药物

培西加南(pexiganan，序列为GIGKFLKKAKKFGKA-FVKILKK)为爪蟾蛙皮素类似物。它是一种治疗轻度糖尿病足感染的局部用广谱生物药物。Genaera 公司已完成了培西加南治疗糖尿病足坏疽的III期临床试验，实验说明轻度糖尿病足坏疽的患者局部的使用培西加南软膏和口服氧氟沙星没有明显差异，而相比于喹诺酮类抗生素，培西加南的不良反应较低。培西加南可以同时抑制革兰阳性菌和革兰阴性菌感染，其作用机制可能与此有关[23]。Kulkarni等[28]对培西加南进行结构修饰，将序列中的赖氨酸全部用精氨酸替换，替换后的肽对蛋白酶的敏感性明显降低了，其抗利什曼原虫的体外生物活性也提高了。

奥米加南(omiganan)是一种人工合成的indolicidin类似物，序列为ILRWPWWPWRRK-NH2，具有抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的活性，对真菌(酵母和霉菌)也具有一定的抗菌活性。最典型的就是用于治疗痤疮和酒渣鼻[24]。BioWest Therapeutics公司对Omiganan就血管的局部感染进行开发，目前在美国已进入了III期临床试验，是一种极具发展潜力的抗菌药物。

Raventos等[29]通过高通量突变筛选得到了一种新的菌丝霉素Plectasin NZ2114。菌丝霉素Plectasin NZ2114是从腐生子囊菌pseudoplectania nigrella中分离得到的一种防御素家族抗菌肽，它通过与Lipid Ⅱ的磷脂部分直接结合抑制细胞壁的合成。它对抗青霉素的耐药肺炎链球菌具有较强的抗性(MIC为0.125～0.5 mg/L)但对包括抗万古霉素菌在内的肠球菌属抗性较低(MIC为32～≥128 mg/L)。研究显示Plectasin与青霉素G、头孢曲松有协同作用对抗金换色葡萄球菌[30]。在动物模型中NZ2114抗菌肽对葡萄球菌引起的心内膜炎有较好的疗效[27]。

抗菌肽MU1140是一种由Streptococcus mutans产生的羊毛硫抗菌肽，含有22个氨基酸,它是通过结合Lipid Ⅱ抑制肽聚糖的合成而发挥作用[31]。Ghobrial等[32]对MU1140的药效学和耐药性进行了生物研究，表明MU1140对肺炎链球菌和多药耐药的金黄色葡萄球菌具有很强的杀伤作用，而对耐万古霉素的粪肠球菌(VREF)具有抑菌作用。Oragenics 公司与Intrexon公司在2012年合作共同生产开发MU1140及其他羊毛硫酸抗菌肽。虽然Oragenics 公司并没有向美国FDA提出对 MU1140 研究性新药的申请，但MU1140作为抗菌新药还是非常有前景的[26]。

4 讨论与展望

抗菌肽的发展也存在一些问题：抗菌肽的不稳定性，容易酶解，生理性液体如血浆、唾液、血清、痰存在的条件下会大大降低抗菌肽的抗菌活性。有些抗菌肽的溶血活性太高。还有些临床应用问题，如抗菌肽的成本高、体内有限稳定性、微生物耐受性(膜变异)、异质性、未知毒理和药代动力学等。对此，新型抗菌肽的发现和设计是至关重要的。近些年计算机辅助抗菌肽的发现和设计越来越得到人们的关注。人们相信随着科学技术的不断发展，更多潜在的抗菌肽被发现，充分的应用到食品、医药等行业中。

[1] Bentley R. The development of penicillin: genesis of a famous antibiotic[J]. Perspect Biol Med,2005,48(3):444-452.

[2] Silver LL.Challenges of antibacterial discovery[J].Clin Microbiol Rev,2011,24(1): 71-109.

[3] Taubes G.The bacteria fight back[J].Science,2008,321(5887): 356-361.

[4] Torres C.Up against the wall[J].Nat Med,2010,16(6): 628-631.

[5] Mangoni M.Bhunia A.Editorial: Antimicrobial Peptides in Medicinal Chemistry: Advances and Applications[J].Curr Top Med Chem,2016,16(1): 2-3.

[6] Zhu X,Dong N,Wang Z,et al.Design of imperfectly amphipathic α-helical antimicrobial peptides with enhanced cell selectivity[J].Acta Biomater,2014,10(1): 244-257.

[7] Choi H,Rangarajan N,Weisshaar JC.Lights, Camera, Action! Antimicrobial Peptide Mechanisms Imaged in Space and Time[J].Trends Microbiol,2016,24(2): 111-122.

[8] Dagan A,Efron L,Gaidukov L,et al.In vitro antiplasmodium effects of dermaseptin S4 derivatives[J].Antimicrob Agents Chemother,2002,46(4): 1059-1066.

[9] Matsuzaki K,Sugishita K,Ishibe N,et al.Relationship of membrane curvature to the formation of pores by magainin 2[J].Biochemistry,1998,37(34): 11856-11863.

[10] Yoneyama F,Imura Y,Ohno K, et al.Peptide-lipid huge toroidal pore, a new antimicrobial mechanism mediated by a lactococcal bacteriocin, lacticin Q[J].Antimicrob Agents Chemother,2009,53(8): 3211-3217.

[11] Zhang LJ,Gallo RL.Antimicrobial peptides[J].Curr Biol,2016,26(1): R14-19.

[12] Shai Y. Mechanism of the binding, insertion and destabilization of phospholipid bilayer membranes by alpha-helical antimicrobial and cell non-selective membrane-lytic peptides[J]. Biochim Biophys Acta,1999,1462(1-2): 55-70.

[13] Tossi A,Sandri L,Giangaspero A.Amphipathic, alpha-helical antimicrobial peptides[J].Biopolymers,2000,55(1): 4-30.

[14] Lu Y,Zhang TF,Shi Y,et al.PFR peptide, one of the antimicrobial peptides identified from the derivatives of lactoferrin, induces necrosis in leukemia cells[J].Sci Rep,2016(6): 20823.

[15] Tyagi A，Kapoor P，Kumar R，et al.In Silico Models for Designing and Discovering Novel Anticancer Peptides[J].Sci Rep,2013(3): 2984.

[16] Powers JP,Hancock RE.The relationship between peptide structure and antibacterial activity[J].Peptides,2003,24(11): 1681-1691.

[17] Lee K,Shin SY,Kim K,et al.Antibiotic activity and structural analysis of the scorpion-derived antimicrobial peptide IsCT and its analogs[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,323(2): 712-719.

[18] Lv Y，Wang J，Gao H，et al.Antimicrobial properties and membrane-active mechanism of a potential α-helical antimicrobial derived from cathelicidin PMAP-36[J].PLoS One,2014,9(1): e86364.

[19] Panteleev PV，Bolosov IA，Balandin SV，et al.Design of antimicrobial peptide arenicin analogs with improved therapeutic indices[J].J Pept Sci,2015,21(2): 105-113.

[20] Panteleev PV,Bolosov IA,Ovchinnikova TV.Bioengineering and functional characterization of arenicin shortened analogs with enhanced antibacterial activity and cell selectivity[J].J Pept Sci,2016,22(2): 82-91.

[21] Da CJP,Cova M,Ferreira R，et al.Antimicrobial peptides: an alternative for innovative medicines[J].Appl Microbiol Biotechnol,2015,99(5): 2023-2040.

[22] Blair HA,Keating GM.Albiglutide: a review of its use in patients with type 2 diabetes mellitus[J].Drugs,2015,75(6): 651-663.

[23] Gottler LM,Ramamoorthy A.Structure, membrane orientation, mechanism, and function of pexiganan-a highly potent antimicrobial peptide designed from magainin[J].Biochim Biophys Acta,2009,1788(8): 1680-1686.

[24] Fritsche TR,Rhomberg PR,Sader HS,et al.Antimicrobial activity of omiganan pentahydrochloride tested against contemporary bacterial pathogens commonly responsible for catheter-associated infections[J].J Antimicrob Chemother,2008,61(5): 1092-1098.

[25] Rubinchik E，Dugourd D，Algara T，et al.Antimicrobial and antifungal activities of a novel cationic antimicrobial peptide, omiganan, in experimental skin colonisation models[J].Int J Antimicrob Agents,2009,34(5): 457-461.

[26] Fox JL.Antimicrobial peptides stage a comeback[J].Nat Biotechnol,2013,31(5): 379-382.

[27] Marr AK,Gooderham WJ,Hancock RE.Antibacterial peptides for therapeutic use: obstacles and realistic outlook[J].Curr Opin Pharmacol,2006,6(5): 468-472.

[28] Kulkarni MM,Karafova A,Kamysz W,et al.Design of protease-resistant pexiganan enhances antileishmanial activity[J].Parasitol Res,2014,113(5): 1971-1976.

[29] Raventós D，Taboureau O，Mygind PH，et al.Improving on nature’s defenses: optimization & high throughput screening of antimicrobial peptides[J].Comb Chem High Throughput Screen,2005,8(3): 219-233.

[30] Breidenstein EB,Courvalin P,Meziane-Cherif D.Antimicrobial Activity of Plectasin NZ2114 in Combination with Cell Wall Targeting Antibiotics Against VanA-Type Enterococcus faecalis[J].Microb Drug Resist,2015,21(4): 373-379.

[31] 孙健，郑珩，徐寒梅. 羊毛硫抗生素的研究进展及其应用. 国外医药(抗生素分册)，2013，34(2)：49-52.

[32] Ghobrial OG,Derendorf H,Hillman JD.Pharmacodynamic activity of the lantibiotic MU1140[J].Int J Antimicrob Agents,2009,33(1):70-74.

(编校：王冬梅)

Advance in mechanism and application of antibacterial peptide

LIU Shi-cai, FAN Lin-lin, ZHENG HengΔ, ZHANG Qiu-yi

(School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009,China)

In the era of outbreaking of antibiotic resistance, the discovery of new antibacterial drugs is emergent.Antimicrobial peptides are important components of the natural defenses of most living organisms against invading pathogens.The unique antibacterial mechanism, direct bactericidal effect, relatively slow of resistance acquirement, and can used alone or combined with antibiotics, make antimicrobial peptides be attractive potential antibacterial drugs.In this paper, we review the physicochemical property of antibacterial peptides, action mechanism and design of antimicrobial peptides, and give a brief introduction of several promising antimicrobial peptides.

antibiotic resistance; antimicrobial peptides; action mechanism; design of antimicrobial peptides; application progress

江苏高校品牌专业建设工程(PPZY2015A057)；江苏高校优势学科建设工程资助项目；大学生创新创业训练计划项目

刘世财，男，硕士在读，研究方向：抗菌肽的研究开发，E-mail:liushicainj@163.com；郑珩，通信作者，男，博士，教授，研究方向：微生物药物的研发，E-mail:zhengh18@hotmail.com。

R978.1

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.05