一测多评法测定垂盆草颗粒中槲皮素、山奈素与异鼠李素含量

郭燕娜，胡华杰

(浙江省舟山医院 药剂科，浙江 舟山 316000)

一测多评法测定垂盆草颗粒中槲皮素、山奈素与异鼠李素含量

郭燕娜Δ，胡华杰

(浙江省舟山医院 药剂科，浙江 舟山 316000)

目的 建立一测多评方法，测定垂盆草颗粒中槲皮素、山奈素与异鼠李素含量为控制垂盆草颗粒的质量提供依据。方法 采用岛津C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动性为甲醇-水(含0.4%磷酸溶液)=50:40；流速为1.0 mL/min；检测波长360 nm；进样量：10 μL；以槲皮素为参考建立山奈素和异鼠李素间的相对校正因子，考察其重现性，比较计算值与测得值的差异。结果 槲皮素、山奈素和异鼠李素分别在32.36～426.43 μg、11.56～136.87 μg 、10.45～155.68 μg呈良好的线性关系，回归方程分别为：Y=3625.8X-13658(R2=0.9998)、Y=2682.9X-10253(R2=0.9999)、Y=3012.2X-11223(R2=0.9999)。平均加样回收率分别为99.3%、99.6%、98.5%(RSD均<1.0%)。用一测多评法对10批垂盆草颗粒中槲皮素、山奈素与异鼠李素进行测定的结果与外标法实测值基本一致。结论 该方法可靠，结果准确，可用于垂盆草颗粒的质量控制。

一测多评；垂盆草颗粒；槲皮素；山奈素；异鼠李素

垂盆草颗粒是提取垂盆草新鲜全草制备而来的，它具有清利湿热、降低谷丙转氨酶的作用，临床上用于急性肝炎、迁移性肝炎及慢性肝炎活动期的治疗[1]。据文献报道[2-3]，垂盆草中含有黄酮及其苷、三萜、甾醇、生物碱、氰苷、氨基酸、糖类等化合物。而大部分黄酮醇苷结构已经通过其水解后的苷元, 如槲皮素、山柰酚、异鼠李素等得到证实。2015年版《中国药典》一部制定垂盆草颗粒中芦丁质控方法和限度，未对槲皮素、山奈素和异鼠李素做质控要求，近年来，虽已有文献[1-4]对上述成分做了研究，但是涉及到多种对照物质，检验成本高。2006年，王智民等[5]最早建立利用一测多评法来控制中成药多成分的考察模式,实现以一种对照物质同时检测多种成分，方法简便实用，经济合理，目前在中药领域得到了广泛应用。

本实验以槲皮素为参照物，建立其与山奈素和异鼠李素间的相对校正因子，实现以一种对照物质对垂盆草颗粒中的多成分进行质量控制，这为更真实评价垂盆草颗粒质量提供了全新模式，以便控制药品质量。通过考察不同色谱仪器和色谱柱对方法进行验证，并通过比较一测多评法与外标法检测结果的差异来验证一测多评的准确性和可靠性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂：垂盆草颗粒10批(上海静安制药有限公司，规格：5g/袋，批号：20150503、20150617、20150715、20150729、20150816、20150830、20150914、20150929、20151016、20151117)；槲皮素对照品(批号：100081-20907，含量：97.4%)、异鼠李素对照品(批号：110860-201109，含量：99.0%)、山奈素对照品(批号：110861-201209，含量：93.2%)均购自中国药品生物制品检定研究院；甲醇为色谱纯，水为纯化水。

1.1.2 实验仪器：戴安Ultimate 3000系列高效液相色谱仪(SRD-3400A分析泵、WPS-3000自动进样器、TCC-3000SD柱温箱、VDW-3000检测器、工作站：Chromeleon©Dionex)，色谱柱：岛津ODS (250 mm×4.6 mm，5 μm)；AB-135S型电子天平(梅特勒-托利多国际股份有限公司，D=0.01 mg)。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件：流动相：甲醇-水(含0.4%磷酸溶液)=50:40；检测波长：360 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

1.2.2 对照品溶液的制备：分别精密称取槲皮素、山柰素和异鼠李素对照品适量，置200 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述对照品混合溶液5 mL置50 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含槲皮素、山柰素和异鼠李素16.2、5.8、5.2 μg的对照品混合溶液，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

1.2.3 供试品溶液的制备：取混合均匀的垂盆草颗粒约5 g，研细，精密称定，置100 mL烧瓶中，加25 mL的甲醇-20%盐酸溶液(5:1)混合溶液，加热回流2 h，期间用甲醇-20%盐酸溶液(5:1)补足减失的重量，放冷，混匀后，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

1.2.4 阴性样品溶液的制备：按处方制备缺槲皮素、山柰素和异鼠李素的阴性样品，按1.2.3项下方法制备阴性供试品溶液。

1.2.5 方法学考察

① 线性关系的考察：精密吸取1.2.2项下的混合对照品溶液2、5、10、15、20、25 μL，分别按照1.2.1色谱条件进样，记录色谱图，计算峰面积。

② 稳定性试验：取同一批供试品溶液，放置0、2、4、6、8、10 h后按照1.2.1色谱条件进样，记录色谱图，计算峰面积。

③ 精密度试验：取混合对照品溶液，按照1.2.1色谱条件连续进样6针。记录色谱图，计算峰面积。

④ 加样回收率试验：取6份已知含量的垂盆草颗粒，分别加入一定量的槲皮素、山奈素和异鼠李素对照品，按照1.2.1色谱条件进样，计算峰面积、回收率。

⑤ 相对校正因子的计算：以槲皮素为内参物，按下式计算相对校正因子：f=fs/fi=AsCi/AiCs

式中As为内参物对照品峰面积，Ai为待测成分峰面积，Cs为内参物浓度， Ci待测成分浓度。

精密吸取“1.2.2”项下混合对照品溶液 2、5、10、15、20、25 μL，分别进样测定。

1.2.6 相对校正因子的重现性考察

① 高效液相色谱仪及色谱柱考察：分别考察Agilent 1260infinity、SHIMADZU LC-10tvp和Waters 2695-2489高效液相色谱仪，考察Sunfire C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Thermo C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)和SHIMADZU C18(4.6 mm×250 mm，4.5 μm)色谱柱对相对校正因子的影响。

② 色谱峰专属性考察：色谱峰准确定位是保证一测多评法应用的前提，本实验中利用相对保留时间进行定位，采用槲皮素与山奈素和异鼠李素的相对保留时间结合色谱图的整体特征，结合不同高效液相色谱仪和色谱柱来定位目标成分。

1.2.7 样品测定 取10批不同批号的垂盆草颗粒，采用外标法和一测多评法分别计算垂盆草颗粒中槲皮素、山奈素和异鼠李素的含量。

2 结果

2.1 线性关系的考察 对照品、阴性样品和样品的HPLC色谱图(见图2)，以进样量为横坐标(X)、峰面积积分值为纵坐标(Y)进行线性回归，槲皮素、山奈素和异鼠李素的回归方程(见图1)分别为：

Y=3625.8X-13658，R2=0.9998；Y=2682.9X-10253，R2=0.9999；Y=3012.2X-11223，R2=0.9999。

图1 垂盆草颗粒标准曲线图Fig.1 Linear regression trend of Chuipencao granules

结果表明,槲皮素、山奈素和异鼠李素进样量分别在32.36～426.43 μg、11.56～136.87 μg 、10.45～155.68 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

图2 阴性样品(A)、对照品(B)和样品(C)和HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of negative sample(A),mixed standard (B) and sample(C)

2.2 稳定性试验 槲皮素、山奈素和异鼠李素峰面积的RSD分别为0.4%、0.3%和0.5%(n=6)，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.3 精密度试验 槲皮素、山奈素和异鼠李素峰面积的RSD分别为0.8%、0.4%和0.9%(n=6)，表明仪器的精密度良好。

2.4 加样回收率试验 槲皮素、山奈素和异鼠李素的回收率，结果见表1-3。

表1 山奈素回收率测定结果(n=6)

表2 槲皮素回收率测定结果(n=6)

表3 异鼠李素回收率测定结果(n=6)

2.5 相对校正因子的计算 山奈素和异鼠李素的校正因子分别为0.721和1.901，RSD分别为0.3%和0.2%，均小于1.0%，表明相对校正因子重现性很好。

2.6 相对校正因子的重现性考察

2.6.1 高效液相色谱仪及色谱柱考察：色谱柱和色谱仪这2个因素对相对校正因子的影响较小(RSD均小于要求的5%)，说明一测多评法可以运用在检测垂盆草颗粒中槲皮素、山奈素和异鼠李素成分中，以槲皮素为内标参考物，利用相对校正因子0.720和1.905分别来计算样品中山奈素和异鼠李素的含量。见表4。

表4 高效液相色谱仪及色谱柱对相对校正因子的影响

2.6.2 色谱峰专属性考察：使用通过考察的色谱条件，利用不同色谱仪和色谱柱进行测定分析，山奈素和异鼠李素相对保留时间的RSD分别为0.4%和0.6%，表明相对位置较为固定，重现性较好，并通过相应出峰的光谱图来确定各成分的同一性，可以认为本一测多评法能作为垂盆草颗粒标准制定的参考依据。见表5。

表5 不同色谱仪及色谱柱对相对保留时间的影响

2.7 样品测定 采用2种方法所得的10批垂盆草颗粒中2种成分含量测定值的RSD值均小于1.0%，可以认为2种方法测得的结果基本一致；采用外标法实测含量与一测多评计算的含夹角余弦值进行比较[3]，夹角余弦值分别为0.999 8和0.999 9，表明2种方法测得的含量没有显著性差异，一测多评法可以作为该品种的分析方法。见表6。

表6 样品的测定结果

3 讨论

在实验过程中，通过反复实验比对，2015版《中国药典》一部中垂盆草药材[6]项下色谱条件和样品配制方法可以作为本实验的参考。在样品提取方式的选择上，分别考察了超声和回流3种供试品提取方法，结果超声提取不完全，采用回流提取时，3种成分含量均有很大程度的提高，并且回流2 h时各成分基本提取完全。提取溶媒的选择方面，实验结合3种成分的溶解特性，分别以水、甲醇、50甲醇水、甲醇-20%盐酸溶液(5:1)混合溶液对样品进行提取，结果采用甲醇-20%盐酸溶液(5:1)混合溶液时提取最完全。

在流动相选择时，本实验分别采用乙腈-0.2%磷酸溶液和甲醇-0.4%磷酸溶液系统进行比较，结果采用乙腈-0.2%磷酸溶液时，山奈素和异鼠李素分离达不到要求；采用甲醇-0.4%磷酸溶液系统则能实现各成分的基线分离，理论塔板数也较前者有所提高，峰形较好，故以甲醇-0.4%磷酸溶液作为流动相。

一测多评法(QAMS)可在待测成分对照品不易得到或不稳定等情况下，使用一种对照物质、利用相对校正因子同时测定多成分的含量，目前，QAMS法已在中药材及饮片质量评价中广泛应用[7-12]。此种方法不仅大大地节省了检验成本，同时也极大地简化了实验操作，有效提高了工作效率和实验准确性，方法有效可行，可以为制定本药品标准提供参考。

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[6] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典(一部)[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：198-199.

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(编校：王冬梅)

Content determination of quercetin，kaempferide and isohamnetin in Chuipencao granules by quantitative analysis of multi- components by single-marker

GUO Yan-naΔ, HU Hua-jie

(Department of Pharmacy, Zhoushan Hospital of Zhejiang, Zhoushan 316000, China)

ObjectiveTo develop a method of quantitative analysis of multi-components by single marker(QAMS)for determination of quercetin，kaempferide，isohamnetin in Chuipencao granules，providing method to control the quality of Chuipencao granules.MethodsThe analysis was performed at 30 ℃，on an Shimadzu C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm)，and the mobile phase was methanol -0.4% phosphoric acid solution .The flow rate was 1.0 mL/min，and the injection volume was 10 μL.Quercetin as a reference to establish the relative correction factor kaempferol and between isorhmnetin, the method was evaluated for reproducibility, and the difference between calculated and measured values was compared.ResultsQuercetin, kaempferol and isorhmnetin respectively 32.36-426.43 μg, 11.56-136.87 μg, 10.45-155.68 μg showed a good linear relationship, and the regression equation was:Y=3625.8X-13658 (R2=0.9998),Y=2682.9X-10253(R2=0.9999),Y=3012.2X-11223 (R2= 0.9999).The average recoveries were 99.3%, 99.6%, 98.5% (RSD were less than 1.0%).Determination of 10 batches of Chuipencao granules with QAMS and external standard method, kaempferol and isorhamnetin were measured, and measured values were basically the same.ConclusionThe QAMS method is reliable and accurate, which might be used for the quality control of Chuipencao granules.

quantitative analysis of multi-components by single marker(QAMS); Chuipencao granules; quercetin; kaempferide; isohamnetin

郭燕娜，通信作者，女，本科，中药师，研究方向：中药(中成药)质量控制，E-mail：3357766703@qq.com。

R969.3

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.63