刺芹侧耳降解孔雀石绿的酶学研究

吕国英　张作法　程鸯祺（. 浙江省农业科学院园艺研究所，浙江 杭州 300；. 浙江工业大学药学院，浙江 杭州 3004）



刺芹侧耳降解孔雀石绿的酶学研究

吕国英1张作法1程鸯祺2
（1. 浙江省农业科学院园艺研究所，浙江 杭州 310021；2. 浙江工业大学药学院，浙江 杭州 310014）

关键词刺芹侧耳；降解；酶；孔雀石绿

白腐真菌是目前研究最多、染料脱色过程中最有效的真菌资源。许多研究表明，真菌降解染料主要是由于其具有非特异性和非选择性的胞外酶系。白腐真菌产生的木质素降解酶系，主要由漆酶、锰过氧化物酶、木素过氧化物组成［1，2］，为非底物专一性酶，分泌到细胞外对多种有机物和染料具有广谱的氧化降解作用。

孔雀石绿（Malachite green，MG）及其代谢物无色孔雀石绿结构稳定，不易分解，故在环境和生物体中代谢缓慢，容易积累，已被科学界确认具有高毒、高残留、“三致”等毒副作用［3］。目前分离到的对孔雀石绿具有脱色作用的微生物有细菌、酵母、丝状真菌、微藻等［4～7］。利用大型真菌摇瓶发酵液来降解孔雀石绿的研究少见报道，本实验室在前期研究的基础上筛选到一株刺芹侧耳M1，其对MG具有良好的降解效果。本研究考察了刺芹侧耳M1降解孔雀石绿的一些相关酶的酶活变化情况，为阐明脱色机理提供了理论基础。

1　材料与方法

1.1实验材料

供试菌种刺芹侧耳 M1（Pleurotus eryngii M1，本实验室前期筛选得到）4 ℃保存于 PDA斜面培养基；孔雀石绿（MG）购自国药集团化学试剂有限公司；其他生化试剂均为国产分析纯。

1.2培养基

PDA斜面培养基：马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L。PDA液体培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L。

1.3摇瓶发酵培养

从活化的斜面培养基上取一定量的菌丝块接种到100 mL PDA 液体培养基中，置于250 mL三角瓶，150 r/min，25 ℃下振荡培养5天。

1.4酶液提取

胞外酶提取：培养后的菌液于10 000 rpm下离心10 min，取上清即为胞外酶液。

胞内酶提取：培养后的菌液于10 000 rpm下离心10 min，沉淀用0.9%NaCl溶液细胞洗涤3次，悬浮于磷酸缓冲液（100 mM，pH 7.4）中，超声波处理5 min，悬浮液离心（10 000 rpm，4℃，15 min），弃沉淀，上清液即为胞内酶液。

1.5酶活测定

酪氨酸酶、漆酶、锰过氧化酶、木质素过氧化酶和NADH-DCIP还原酶测定方法见文献［8］，作少许改动。蛋白测定采用考马斯亮蓝法。

1个酶活力单位是指在特定条件（25 ℃，其他为最适条件）下，在1 min内转化1 μmol底物的酶量，或是转化底物中1 μmol的有关基团的酶量。

比活为每分钟每毫克酶蛋白在 25 ℃下转化的底物的微摩尔数。

1.6脱色率的测定

Ao，At分别表示初始时刻和t时刻染料在619 nm波长处的吸光值。

1.7酶的初步分离纯化

分别对胞内酶液和胞外酶液进行蛋白质分级纯化。以100 mL酶液为例，硫酸铵在25 ℃时的溶解度为75 g，边搅拌边缓慢加入无水硫酸铵，分别在酶液中的硫酸铵达到溶解度的20%、40%、60%、80%、100%时提取沉淀，即0～20%、20%～40%、40%～60%、60%～80%、80%～100%区间内的蛋白质。蛋白质溶于pH=7.0的磷酸缓冲液中，制成酶液，再测蛋白浓度、降解率等参数。

2　结果与分析

2.1酶活比较

测定酶活的酶液分为脱色前和脱色后两种，数据显示，胞内酶液中的各酶活在加入MG后都略有降低，而在胞外酶液中，这一现象并不明显，其中酪氨酸酶和木质素氧化酶有降低的趋势，而漆酶和NADH-DCIP还原酶反而有所升高。文献报道［8］，MG在脱色前后反应体系中起作用的酶的酶活将发生新变化，虽然本研究中的这几种酶的酶活都有变化，但是除了漆酶外，其他酶活变化都很小（表1），基本可以忽略。已有文献报道，一种白腐菌 Trametes sp.中的漆酶可以脱色 MG溶液［9］，所以我们推测在本研究的降解MG过程中漆酶起主要作用。

表1　脱色前后胞内外酶活的变化

2.2酶的初步分离

胞内酶液的分离纯化结果显示，硫酸铵溶解度的20%～40%区间内分离到的蛋白质最多，其次是 40%～60%区间。在0～20%区间内的蛋白质较少。蛋白质在分离纯化过程中会有损失，蛋白质的最后回收率为71.8%（表2）。

表2　胞内酶液分级沉淀结果

胞外酶液的分离纯化结果为：硫酸铵溶解度在80%～100%区间内分离到的蛋白质最多，其次是60%～80%区间，0～20%区间内没有分离到蛋白质。胞外酶液中，蛋白质损失较大，回收率只有38.8%（表3）。

表3　胞外酶液分级沉淀结果

用原酶液和各区间分离到的酶液去降解孔雀石绿染料，在MG浓度相等的情况下，得出每毫克蛋白能达到的降解率，定义为单位降解率。结果如图1所示，胞内酶液的0～20%组分的蛋白质浓度虽然很低，但是其活性很高，每毫克蛋白分担到的降解率是最高的。胞外酶液的20%～40%区间组分的单位降解率原高于其他组分，而0～20%区间组分检测不到蛋白质存在。

图1　各组分酶液MG降解率

3　讨 论

孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体，属三苯甲烷类染料，过去常被作为驱虫剂、杀菌剂、防腐剂在水产中使用。由于其毒副作用大，虽然早已禁用，但研究废水中所含孔雀石绿染料的脱色降解，对于治理染料的污染仍具有重要的理论意义和实用价值。

通过测定胞内外酶液中相关酶活，可以看出漆酶活性比其他酶要高，漆酶比活是其他酶活的好几十倍。相对于胞内酶液，胞外酶液中的漆酶比活虽有所降低，但仍高于其他酶。胞外液中的酪氨酸酶、木质素氧化酶和NADH-DCIP还原酶的比活都略高于胞内，锰过氧化酶胞内胞外比活都很低。可以推测在脱色过程中起主要作用的是漆酶。对胞内外酶液的硫酸铵沉淀进行初步分离后，进行脱色测定，发现在胞内酶液中活性主要集中在硫酸铵 0～20%组分中，虽然此组分的蛋白含量最少；而在胞外酶液中除了硫酸铵 0～20%区间组分检测活性外，其他组分均有较高的活性，其中在20%～40%的组分中活性为最大，这也间接证明了胞外酶活性高于胞内酶活性。

参考文献

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［8］ Du， L.N.， Zhao， M.， Li， G.， et al. Biodegradation of malachite green by Micrococcus sp. strain BD15: Biodegradation pathway and enzyme analysis ［J］. Int. Biodeter Biodegr， 2013， 78: 108-116.

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中图分类号：S646

文献标识码：A

文章编号：2095-0934（2016）01-048-03

基金项目：浙江省农科院2014年创新提升工程项目；浙江省食用菌育种专项（2012C12911）

作者简介：吕国英，博士，副研究员，主要从事食药用菌研究工作。E-mail：bdzlgy@sohu.com