真姬菇液体培养特性及胞外酶的活性研究

张文斌　李文德　王治江　王少秋（. 甘肃省张掖市经济作物推广站，甘肃 张掖 734000；. 河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000）



真姬菇液体培养特性及胞外酶的活性研究

张文斌1李文德1王治江2*王少秋2
（1. 甘肃省张掖市经济作物推广站，甘肃 张掖 734000；2. 河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000）

摘 要通过液体发酵方式，测定不同碳源、氮源、矿质元素、初始pH对真姬菇菌丝生长的影响及胞外酶活性。结果表明：真姬菇液体培养最适的碳源为可溶性淀粉，最佳氮源为蛋白胨，最佳矿质元素是硫酸铜，适宜于生长的初始pH为4～6。在整个发酵期内，淀粉酶、羧甲基纤维素酶、邻苯二酚氧化酶、愈创木酚氧化酶的酶活性高峰交替出现。其中：愈创木酚酶、羧甲基纤维素酶活性在第2天为高峰，邻苯二酚酶出现在第3天，淀粉酶在第4天达到高峰。

关键词真姬菇；液体培养；特性；胞外酶活性

真姬菇（Hypsizygus marmoreus）又名玉蕈、斑玉蕈、蟹味菇、海鲜菇，秋季群生于阔叶树的朽木上，广泛分布于日本、欧洲、北美、西伯利亚等地。形态美观、肉质脆嫩，味道鲜美似螃蟹。在日本有“香在松口蘑，味在玉蕈”之说［1］，隶属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、玉蕈属，是北温带一种优良的食用菌。富含赖氨酸、精氨酸、葡聚糖，具有促进青少年智力发育、抗癌、抵抗HIV病毒、降血压、降低胆固醇、提高人体免疫力等功效［2］。

利用传统的工艺生产固体菌种，生产周期长、环节多，污染不易控制；利用液体培养生产液体菌种有生产周期短、菌龄一致、接种简便、成本低的优点［3］。近年来真姬菇的相关研究报道侧重栽培和生物学特性方面，营养生理研究较少。笔者测定了真姬菇生长发育过程中羧甲基纤维素酶、淀粉酶、邻苯二酚氧化酶、愈创木酚氧化酶的活性变化，以期从中找出真姬菇在生长发育过程中胞外酶的变化规律，为促进真姬菇液体菌种工厂化生产提供理论依据。

1　试验材料

1.1菌种

真姬菇菌种购自北京吉蕈园科技有限公司。供试碳源为可溶性淀粉、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇，均为分析纯。供试氮源为蛋白胨、酵母膏、硝酸钾、硝酸铵、尿素，均为分析纯。麸皮购于张掖市市场。矿质元素为硫酸铜、硫酸亚铁、磷酸二氢钾、硫酸锰、硫酸镁、硫酸锌，均为分析纯。

1.2培养基

母种培养基配方：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、琼脂20 g、磷酸二氢钾0.5 g、硫酸镁0.5 g、水1 000 mL。液体种培养基为不加琼脂的母种培养基。碳源基础培养基为母种培养基中葡萄糖用供试碳源代替。氮源基础培养基为母种培养基中将蛋白胨用供试氮源代替。矿质元素基础培养基为母种培养基中将磷酸二氢钾、硫酸镁用供试矿质元素代替。初始pH基础培养基为在母种培养基中用10%的盐酸和10%的氢氧化钠调至所需pH。

2　试验方法

2.1液体菌种培养

将配制好的液体培养基分装于250 mL三角瓶中，每瓶100 mL，121 ℃灭菌30 min，冷却后接入已经活化的斜面母种（0.5 cm×0.5 cm）5片，在25 ℃、110 r/min恒温振荡培养1周。

2.2真姬菇培养特性研究

（1）不同碳源对真姬菇菌丝生长量的影响。分别称取葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉各20 g，溶于1 000 mL供试碳源基础培养基后，分装于250 mL的三角瓶中，每瓶装液量100 mL，每种碳源3次重复，经灭菌后接入5%的液体菌种，在25 ℃、110 r/min条件下恒温振荡培养。7天后测定菌丝生物量、菌液中残糖量、菌液pH。

（2）不同氮源对真姬菇菌丝生长量的影响。分别称取蛋白胨、酵母膏、尿素、硝酸铵、硝酸钾、麸皮各4 g，溶于1 000 mL供试氮源基础培养基后，分装于250 mL的三角瓶中，每瓶装液量100 mL，每种氮源3次重复，经灭菌后接入5%的液体菌种，25 ℃、110 r/min下恒温振荡培养。7天后测定菌丝生物量、菌液中残糖量、菌液pH。

（3）不同矿质元素对真姬菇菌丝生长量的影响。分别在矿质元素基础培养基中加入硫酸锰、硫酸镁、硫酸锌、硫酸亚铁、硫酸铜、磷酸二氢钾各0.5 g，分装于250 mL的三角瓶中，每瓶装液量100 mL，每处理3次重复，经灭菌后接入5%的液体菌种，25 ℃、110 r/min下恒温振荡培养。7天后测定菌丝生物量、残糖量、终止pH。

（4）初始pH对真姬菇菌丝生长量的影响。用10%氢氧化钠溶液和10%盐酸溶液调节母种培养基初始pH分别为2、4、6、8、10、12，将培养基分装于250 mL的三角瓶中，每瓶装液量100 mL，每处理3次重复。经灭菌后接入5%的液体菌种，在25 ℃、110 r/min下恒温振荡培养。7天后测定菌丝生物量、菌液pH和菌液中残糖量。

2.3胞外酶特性研究

（1）粗酶液的制备。在250 mL的三角瓶中加入100 mL液体培养基，每瓶接入2%的母种培养液，在25 ℃、110 r/min下恒温振荡培养7天。培养结束后将菌液用4层纱布过滤，取滤液10mL于离心管中，在5 ℃、4 000 r/min条件下离心10 min，所得上清液即为粗酶液。

（2）淀粉酶活性的测定。试管中加入0.5%可溶性淀粉溶液（用pH 5.8、0.2 mol/L NaAc-HAc缓冲液配置）1.5 mL，再加稀释10倍的粗酶液0.5 mL，混匀，于38 ℃水浴锅中保温30 min，取出后立即加入DNS试剂1.5 mL，于100 ℃水浴中煮沸5 min，冷却后加入蒸馏水21.5 mL，混匀。用722型可见分光光度计520 nm处测OD值；取煮沸15 min灭活的酶液做对照，每组3个重复。酶活单位以反应前后光密度的改变值表示。

（3）羧甲基纤维素酶活性的测定。试管中加入1.5 mL用pH 4.6、0.1 mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制的0.5%羧甲基纤维素钠溶液，再加入稀释10倍的粗酶液0.5 mL混匀，于50 ℃水浴锅中保温30 min，其后按淀粉酶活性测定方法操作。

（4）邻苯二酚氧化酶活性的测定。试管中加入0.1 mol/L的邻苯二酚溶液2.0 mL及0.07 mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液（pH 6.0）2.0 mL。再加未稀释的粗酶液0.1 mL，混匀，于28 ℃水浴锅中保温30 min后，立即用722型可见分光光度计测400 nm处OD值；取煮沸15 min灭活的酶液做对照，每组3个重复。酶活单位以反应前后光密度的改变值表示。

（5）愈创木酚氧化酶活性的测定。试管中加入0.8 mol/L愈创木酚溶液0.5 mL及0.2 mol/L醋酸-醋酸钠（pH 4.6）缓冲液3.0 mL，再加稀释10倍的粗酶液0.5 mL，混匀，于28 ℃水浴锅中保温30 min后，立即用722型可见分光光度计测490 nm处OD值；取煮沸15 min灭活的酶液做对照，每组3个重复。酶活单位以反应前后光密度的改变值表示。

3　结果与分析

3.1不同碳源菌丝的生长量

碳源主要是提供菌种生命活动所需的能量，构成菌体和代谢产物的物质基础。不同碳源对真姬菇菌丝生长的影响见表 1。6种碳源中以可溶性淀粉的菌丝生长速度较快，为 0.7716 g/100 mL，与其他5种碳源比差异极显著。可溶性淀粉菌丝生长速度较快的原因可能为可溶性淀粉属于多糖，能被真姬菇菌丝更好地分解吸收利用，也可能是淀粉增加了培养基的黏度而有利于菌球的形成。此结果同文献［4］的报道。葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖为碳源，菌丝的生长速度分别为0.3669 g/100 mL、0.3289 g/100 mL、0.3141 g/100 mL、0.2396 g/100 mL，相互之间无显著差异。甘露醇菌丝生长速度较慢，为 0.1978 g/100 mL，与其他5种碳源比有显著差异。

表1　不同碳源与真姬菇菌丝生长的关系

3.2不同氮源的菌丝生长量

氮源主要用于构成菌体细胞物质，包括氨基酸、蛋白质、核酸，以及含氮代谢物。不同氮源对真姬菇菌丝生长的影响见表 2。6种氮源中蛋白胨的菌丝生长速度最快，为0.3669 g/100 mL，与其他5种氮源差异极显著，这一结果同文献［5］的报道。酵母膏与麸皮间无显著差异，但与其他氮源差异显著；硝酸钾与硝酸铵之间无显著差异，但与其他氮源比差异显著；尿素的菌丝生长速度较慢，为0.0509 g/100 mL，与其他5种氮源比差异显著。原因可能是尿素在分解过程中产生氨，不利于菌丝生长。

3.3不同矿质元素的菌丝生长量

6种不同矿质元素对真姬菇菌丝生长的影响差异显著（表3），以硫酸铜的菌丝生长速度较快，为0.3607 g/100 mL，与其他5种矿质元素比差异极显著，这一结果不同于文献［4］的报道。原因可能与真姬菇的不同品种对矿质元素有不同的偏爱有关。硫酸亚铁、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰之间差异不显著，但与硫酸锌差异显著。硫酸锌的菌丝生长速度较慢，为0.1188 g/100 mL，与其他5种矿质元素比差异显著。

表2　不同氮源与真姬菇菌丝生长的关系

表3　不同矿质元素与真姬菇菌丝生长的关系

3.4不同初始pH的菌丝生长量

由图1可知，不同初始pH对真姬菇菌丝生长有影响，适宜的初始pH范围为4～6。初始pH 为4时菌丝生长较快，为0.3339 g/100mL；初始

图1　不同初始pH与真姬菇菌丝生长量的关系

pH为10时生长速度较慢，为0.1969 g/100 mL。

3.5酶活性测定

（1）淀粉酶活性。由图 2可知，在整个发酵培养试验期内，淀粉酶均有活性，在第4天时活性达到高峰。这是因为菌丝生长初期胞外酶分泌较少，能利用的主要是培养基中的小分子碳源。随着菌丝的生长和胞外酶的分泌，淀粉酶活性逐渐升高达到高峰。随着培养时间的继续延长，淀粉含量又复减少，酶活随之逐渐下降，这一结果与文献［6］的报道一致。

图2　淀粉酶活性与培养时间的关系

（2）羧甲基纤维素酶活性。从图 3看，在整个发酵培养试验期内，羧甲基纤维素酶均有活性，在第2天时达到高峰，之后迅速降低，到第6天时最低；而到第7天又上升第二个高峰。

图3　羧甲基纤维素酶活性与培养时间的关系

（3）邻苯二酚氧化酶活性。图 4表明，在整个发酵培养试验期内，邻苯二酚氧化酶均有活性。开始时，邻苯二酚氧化酶的活性上升速度较快，到第3天达第一个峰值；之后活性下降，第5天降到最低值；之后又复上升，这一结果与文献［7］的报道相类似。

图4　邻苯二酚氧化酶活性与培养时间的关系

（4）愈创木酚氧化酶活性。图5表示在整个发酵培养试验期内，愈创木酚氧化酶均有活性，活性第一个高峰出现在培养的第2天；之后开始下降，第4天开始又上升，培养到第7天时，达到第二个高峰。这一结果与文献［8］的报道相似。

图5　愈创木酚氧化酶活性与培养时间的关系

4　讨论与结论

真姬菇液体培养适宜的碳源是可溶性淀粉，原因可能是真姬菇菌丝能分泌淀粉酶，能更好分解吸收利用淀粉；也可能是淀粉增加了培养基的黏度而有利于菌球的形成。最佳氮源是蛋白胨，在有机氮中菌丝生长速度比在无机氮中快。真姬菇液体培养的最佳矿质元素是硫酸铜，这与其他食用菌不同，可能是品种特性所致。适宜生长的最适pH为4～6，与其他食用菌相似。

在整个发酵期内，淀粉酶、羧甲基纤维素酶、邻苯二酚氧化酶、愈创木酚氧化酶的酶活性高峰交替出现。其中愈创木酚酶、羧甲基纤维素酶活性第一次高峰出现较早，为第2天；其次是邻苯二酚酶，在第3天；淀粉酶活性在发酵培养的第4天出现。无论是自然界生长的还是人工栽培的食用菌，其生存环境中的主要碳源是纤维素、半纤维素、木质素和淀粉等大分子有机物［8］。真姬菇菌丝在发酵培养前期主要利用糖类、纤维素，而后期则主要利用木质素。

参考文献

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［3］ 闻毛红， 朱将伟. 食用菌液体培养技术的发展与应用［J］.农家参谋种业大观， 2010， 16（3）: 38.

［4］ 黄清荣， 杨立红， 钟旭升， 等. 真姬菇深层培养碳氮源及无机盐的优选［J］. 湖北农业科学， 2005， 27（6）: 79-81.

［5］ 杨慧， 谭琪， 宋春艳， 等. 斑玉蕈液体菌种培养条件及搔菌时间的筛选［J］. 食用菌学报， 2012， 19（4）: 49-51.

［6］ 杨凤苓， 贾乐， 李明才， 等. 液体培养条件下铬对姬菇胞外酶及胞外多糖的影响［J］. 食品工业科技， 2008，29（12）: 85-87.

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［8］ 回晶， 赵文静， 邹志远， 等. 金耳液体培养过程中几种胞外酶活性的变化规律［J］. 食用菌学报， 2007， 14（3）: 29-32.

Study on Hypsizygus marmoreus characteristics and extracellular enzyme activity in submerged culture

Zhang Wenbin1Li Wende1Wang Zhijiang2*Wang Shaoqiu2
（（1. Zhangye Economic Crops Extending Stations， Zhangye， Gansu 734000；2.Institute of Agricultural and Biological Technology， Hexi University， Zhangye， Gansu 734000））

AbstractSubmerged culture was used to determine the effects of different carbon sources， nitrogen sources， mineral elements and original pH value of mycelial's growth. The results showed that the best carbon source was melted amylon，the best nitrogen source was peptone， the best mineral elements was CuSO4and the best original pH value was 4～6 in all submerged culture period， activity peaks of amylase， carboxy menthel cellulose， polyphenol oxidase and guaiacol oxidase appear with difference. Guaiacol oxidase activity appers peak at the second day. The next is polyphenol oxidase appers at the third day. And， amylase， carboxy menthel cellulose appears at the fourth day.

Key WordsHypsizygus marmoreus； submerged culture； characteristics； extracellular enzyme activity

中图分类号：S646

文献标识码：A

文章编号：2095-0934（2016）01-043-05

基金项目：甘肃省特色产业科技攻关项目；项目编号Gs2014scgg-05（2）

作者简介：张文斌（1966—），推广研究员，主要从事设施蔬菜栽培技术研究与示范工作。E-mail：zhang-wb882003@ yahoo.com.cn

*通讯作者：王治江（1965—），高级实验师，主要从事食用菌栽培与产业化开发工作。E-mail：wangzhijiang0772@163.com