梅童鱼内源蛋白酶自水解工艺的优化

刘汉文， 周志齐， 陈洪兴， 赵朱丽， 刘润煊， 龚星宇，潘凤涛， 季中春

(1盐城工学院海洋与生物工程学院，江苏 盐城 224051；2盐城市怡美食品有限公司，江苏 射阳 224333)



梅童鱼内源蛋白酶自水解工艺的优化

刘汉文1， 周志齐1， 陈洪兴1， 赵朱丽1， 刘润煊1， 龚星宇1，潘凤涛2， 季中春2

(1盐城工学院海洋与生物工程学院，江苏 盐城 224051；2盐城市怡美食品有限公司，江苏 射阳 224333)

摘要：为提高海捕低值鱼加工利用率，合理利用鱼糜及鱼糜制品加工中的副产物，充分利用鱼类自身内源酶，寻求低值鱼精深加工的低碳高效利用，以梅童鱼(Collichthyslucidus)为研究对象，利用鱼类自身的内源蛋白酶将鱼体内的蛋白质酶解，在自然pH条件下，观察了液料比、自溶温度、时间对梅童鱼蛋白水解的影响，以可溶性蛋白/总蛋白的值为响应值，采用响应面分析优化自溶条件。通过求解回归方程得到的最优自溶条件为：液料比3.4，温度53 ℃，时间267 min。经过验证，可溶性蛋白/总蛋白的值为18.35%，与回归方程的预测值18.55%相比，相对误差1.1%，说明模型能较好地预测自溶过程中可溶性蛋白/总蛋白的值。在此条件下，测得水解度为15.84%，过0.45 μm微滤膜蛋白质量比为9.83%。研究表明，该水解工艺可为生产鱼露、活性肽、氨基酸等提供技术依据。

关键词：梅童鱼；内源蛋白酶；自水解；响应面分析

梅童鱼(Collichthyslucidus)是石首鱼科梅童鱼属的一种，是近海常见的小型经济鱼类之一，鱼肉嫩刺软，味道鲜美。梅童鱼主要加工为鱼干、鱼糜及鱼糜制品，在此过程中会产生约占鱼体40%的鱼头、脊骨、鱼皮等副产物。通常情况下，这些副产物只能制作成鱼粉或加工成饲料，极少用于以食用为目的的产品开发，使得原料未能得到充分利用、水产品加工效益偏低[1-3]。梅童鱼营养价值高，特别是鱼头富含磷质，是养脑的滋补品[4-6]。开展海捕鱼精深加工，实现低碳高效利用是产业发展方向[7-11]。利用梅童鱼自身内源蛋白酶将梅童鱼鱼体水解，产生可溶性蛋白、肽以及氨基酸等，开发生产鱼露、不同生理活性的多肽、氨基酸等高值化产品，为梅童鱼内源蛋白酶的利用提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

梅童鱼购于江苏射阳黄沙港海产品市场，贮于冰箱冷冻室(-18 ℃)。牛血清蛋白(BSA)：MW 66700(华美生物工程公司)；实验所用试剂包括95%乙醇、磷酸、无水乙醚、考马斯亮蓝G-250、甲醛、硫酸、硫酸铜、氢氧化钠、硼酸、盐酸等均为分析纯。

1.2仪器与设备

实验仪器与设备包括：JJ-2组织捣碎匀浆机，武汉格莱莫检测设备有限公司；95-1磁力搅拌器，上海志威电器有限公司；PH400台式酸度计(精度0.01)，安莱立思仪器科技(上海)有限公司；UV-9600紫外可见分光光度计(准确度 ± 0.1 nm)，北京瑞利分析仪器有限公司；10～100μL可调量程移液器(精确度 ≤ 1.0%)，德国Peppercorn公司； TGL-16G离心机，美国Labnet公司；202-1AS数显电热干燥箱，上海索谱仪器有限公司；TX223L电子天平(精度1 mg)，日本岛津公司；DK-S26电热恒温水浴锅(温度波动 ± 0.5 ℃)，上海森信实验仪器有限公司；SX2-2.5-10马弗炉，泰州市骏前电热器材有限公司。

1.3方法

1.3.1梅童鱼的主要成分测定与自溶酶解

梅童鱼的主要成分包括水分、粗蛋白质、粗脂肪和灰分，均按照食品的一般分析方法测定[12-15]。

梅童鱼的自溶酶解：将梅童鱼从冰箱中取出，用清水解冻，并将外表面的异物清洗干净，再将其放入组织捣碎匀浆机中，加入一定量的水，打碎成浆。取100 mL鱼浆移入锥形瓶中，在一定温度的水浴锅中保温一定时间，然后以转速4 000 r/min离心5 min，取上清液快速测定相关指标。

1.3.2可溶性蛋白/总蛋白的值测定

采用考马斯亮蓝法[16]测定可溶性蛋白，干扰物质较少，灵敏度高，稳定性好[17-18]。以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白质配制一定浓度梯度的标准蛋白溶液，采用考马斯亮蓝法测定标准蛋白溶液在A595 nm处的吸光值；再以吸光值为纵坐标，蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。将上述自溶酶解上清液在A595 nm处测定吸光值，计算出酶解液中的可溶性蛋白浓度(图1)，y=0.498 2x+0.007；R2=0.996 5。

图1　标准蛋白质曲线Fig.1　The curve of standard protein

可溶性蛋白浓度的计算公式：

x=(A595- 0.007)/0.498 2

式中：x—可溶性蛋白浓度，mg/mL；A595—待测液在A595nm处的吸光值。

可溶性蛋白/总蛋白的值计算公式：

X=C×V/m×100%

式中：X—可溶性蛋白/总蛋白的值，%；C—可溶性蛋白浓度，mg/mL；V—上清液体积，mL；m—上清液中总蛋白质量，mg；

1.3.3其它指标测定

(1)水解度计算公式：

DH=(C1/C0)×100%

式中：C1—氨氮浓度，mg/mL ，甲醛电位法[19]测定；C0—总氮的浓度，mg/mL，凯氏定氮法[13]测定；DH—水解度，%。

(2)过微滤膜蛋白质量比：使用0.45 μm微滤膜，真空抽滤，取滤液于表面皿中，50 ℃烘干12 h，称量。计算公式：

Y=m1/m2×100%

式中：Y—过微滤膜蛋白质量比，%；m1—滤过物质量，mg；m2—可溶性蛋白质量，mg。

2结果与分析

2.1梅童鱼的主要成分

试验结果显示，梅童鱼的主要成分：水分(73.03±0.87)%，灰分(2.24±0.72)%，粗脂肪(7.74±0.73)%，粗蛋白质(16.99±0.64)%。

2.2可溶性蛋白的影响因素

(1)自溶时间对可溶性蛋白的影响。在自然pH、温度55 ℃、液料比为3的条件下，每隔30 min测定可溶性蛋白的浓度，计算可溶性蛋白/总蛋白的值。从结果(图2)可以看出，在0～150 min之内随着鱼肉中可溶性蛋白的浸出及鱼肉蛋白逐渐酶解，可溶性蛋白含量增大较快；150～240 min之间可溶性蛋白含量增长变缓；240 min以后，鱼肉蛋白和可溶性蛋白酶解的速率基本达到平衡，可溶性蛋白含量缓慢下降。所以，考虑到自溶酶解的条件，时间定为240 min。

图2　时间对可溶性蛋白/总蛋白的值影响Fig.2　The influence of time on the solubleprotein/total protein

(2)温度对可溶性蛋白的影响。在自然pH、液料比3、时间为240 min条件下，测定可溶性蛋白的浓度，观察可溶性蛋白/总蛋白的值随温度的变化情况。从结果(图3)可以看出，在45 ℃～60 ℃时，可溶性蛋白/总蛋白的值较大，在55 ℃时为最大。表明在最适温度作用下，酶的活性达到最大，水解反应速率也最大。

图3　温度对可溶性蛋白/总蛋白的值影响Fig.3　The influence of temperature on thesoluble protein/total protein

(3)液料比对可溶性蛋白的影响。在自然pH、温度55 ℃、时间240 min、不同液料比的条件下，测定可溶性蛋白的浓度，观察可溶性蛋白/总蛋白的值随液料比的变化情况。从结果(图4)可以看出，在液料比为1.0～3.0时，可溶性蛋白/总蛋白的值随液料比的增大而增大，但当液料比达到3以后，增加变得缓慢。这是由于在自溶酶解过程中，底物浓度的大小对酶解速率有一定的影响。水有利于底物的扩散，可以使酶与底物更好的接触，但随着液料比继续增大，酶与底物接触机会就会降低，反应速率变慢，可溶性蛋白/总蛋白的值值的增速就会减缓。

图4　液料比对可溶性蛋白/总蛋白的值影响Fig.4　The influence of liquid to sample ratio onthe soluble protein/total protein

2.3响应面设计与结果分析

在单因素试验的基础上，根据Design-Expert 8.0.6响应面分析中的中心组合设计(Central Composite Design, CCD)对自溶条件进行分析优化，以A(时间)、B(温度)、C(液料比)为自变量，中心点分别为240、55、3，变化步长分别为20、5、1，以可溶性蛋白/总蛋白的值为响应值，试验次数为20，中心点有6个。设计方案及结果见表1、表2。

表1　试验因素水平表

表2　中心复合设计及试验结果

表3　回归方程方差分析表

注：*表示显著性水水平P<0.050；**表示显著性水平P<0.010

以可溶性蛋白/总蛋白的值为响应值，对表2中实验数据进行回归拟合和方差分析，得到表3。回归方程模型的F值为62.14(P<0.000 1)，表明模型显著，建立的模型回归方程能较好地解释响应结果，并预测最佳自溶酶解条件。由表3可知，对响应值可溶性蛋白/总蛋白的值作用显著的是A、B、C、BC、A2、B2、C2、A2C。

回归方程为：Y=15.72+1.86×A-0.86×B-1.35×C+0.1×A×B-0.04×A×C+1.22×B×C-0.48×A2-1.15×B2-2.39×C2+3.04×A2×C

由表3可知，失拟项不显著(P=0.158 7>0.05)，而模型的P<0.05，说明模型显著，并且模型的拟合度为0.985 7，信噪比为27.666，说明该模型各因素水平区间设计合理，拟合度良好，可用来预测。

固定3个因素中的1个，作出另2个因素交互作用的响应面(图5、6、7)。由表3可以看出，AB、AC交互作用的P值均大于0.05，BC的P值小于0.05，说明AB、AC的交互作用对可溶性蛋白/总蛋白的值影响不显著，BC的交互作用对可溶性蛋白/总蛋白的值影响显著。

图5　温度与时间对可溶性蛋白/总蛋白的值的影响Fig.5　Response surface showing the effect of timeand temperature on the soluble protein/total protein

从图5可以看出，在液料比一定的情况下，当温度在53.0 ℃左右，响应值出现最大值；而响应值也随时间的增加而增大，当时间为267 min时，可溶性蛋白/总蛋白的值最大。曲面倾斜程度比较小，所以温度与时间对可溶性蛋白/总蛋白的值交互作用较小。

图6　温度和液料比对可溶性蛋白/总蛋白的值影响Fig.6　Response surface showing the effect oftemperature and liquid to sample ratio onthe soluble protein/total protein

从图6可以看出，在时间一定的情况下，从温度的影响来看，可溶性蛋白/总蛋白的值随着液料比的增加而先增大后减小；从液料比的影响来看，可溶性蛋白/总蛋白的值随着温度的升高而先增大后减小。其等高线呈椭圆形，表明温度和液料比交互影响对可溶性蛋白/总蛋白的值影响是显著的。

图7　时间和液料比对可溶性蛋白/总蛋白的值影响Fig.7　Response surface showing the effect oftime and liquid to sample ratio onthe soluble protein/total protein

从图7可以看出，在温度一定的条件下，当液料比为3.4时，响应值随时间而变化，最大值在267 min左右。曲面倾斜程度比较小，所以，时间和液料比对可溶性蛋白/总蛋白的值的交互作用较小。

2.4数学模型验证

利用统计软件Design-Expert 8.0.6 预测可溶性蛋白/总蛋白的值最大时的工艺参数为：自溶时间267 min、温度53.0 ℃、液料比3.38，在此条件下，可溶性蛋白/总蛋白的值的预测值为18.55%。为了检验模型的准确性，考虑操作的可行性，控制温度为53 ℃、液料比为3.4、自溶267 min，做3次平行实验，测得可溶性蛋白/总蛋白的值的平均值分别为18.58%、18.15%、18.33%，均值为18.35%，与模型理论预测值18.55%基本吻合，相对误差1.1%，说明该模型拟合度良好，可用来预测自溶过程中可溶性蛋白/总蛋白的值。

郑杰[20]采用响应面法优化得到海参肠自溶的最佳条件为温度48.30 ℃、pH 4.43、液料比3和自溶时间4 h，预测三氯乙酸-可溶性寡肽含量最大值为32.59 mg/g；徐伟等[21]通过对鱿鱼加工副产物内源酶自溶水解条件的分析研究得到最佳水解条件：温度45.48 ℃，液料比为2.44，初始pH6.420，时间48 h，水解液中的氨基态氮含量为0.4137 g/100 mL；吕英涛[22]在以鱿鱼加工副产物制备鱼酱油过程中，在初始pH9.0、温度50 ℃、时间12 h的条件下，测得酶解液的上清液中α-氨基氮含量为0.4962 g/100 ml。本试验利用梅童鱼在自然pH条件下自溶水解，可溶性蛋白/总蛋白的值达到18.35%，水解度为15.84%，过0.45 μm微滤膜蛋白质量比为9.83%。

3结论

采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白，以可溶性蛋白/总蛋白的值为响应值，在单因素试验基础上，通过响应面分析，对梅童鱼内源蛋白酶自水解的工艺条件进行优化研究，最终确定了自水解的最佳工艺条件为自然pH、温度53 ℃、液料比3.4、自溶267 min，在该条件下，可溶性蛋白/总蛋白的值为18.35%，水解度为15.84%，过0.45 μm微滤膜蛋白质量比为9.83%。验证结果与预测值相比，相对误差1.1%，说明该模型能够较好地预测自溶过程中可溶性蛋白/总蛋白的值。

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Optimization of autohydrolyzing conditions of endogenous proteases fromCollichthyslucidus

LIU Hanwen1, ZHOU Zhiqi1, CHEN Hongxing1, ZHAO Zhuli1, LIU Runxuan1, GONG Xingyu1, PAN Fengtao2, JI Zhongchun2

(1SchoolofOceanandBiologicalEngineering,YanchengInstituteofTechnology,YanchengJiangsu224051,China; 2YanChengYiMeiFoodCo.,Ltd.SheyangJiangsu224333,China)

Abstract：In order to improve the processing and utilization rate of low-value fish species caught from marine capture, rationally use the byproducts from surimi and surimi products processing, make full use fish endogenous enzymes, and seek for the low-carbon, high efficiency deep-processing method for low-value fish,Collichthysluciduswas taken as the object to study the hydrolysis conditions of fish protein using endogenous proteases. Under the condition of natural pH, single factor experiment was adopted to investigate the effects of liquid to sample ratio, temperature and hydrolysis time on the soluble protein/total protein value, and the conditions were optimized as following：liquid to sample ratio being 3.4, temperature 53 ℃, and time 267 min. Under the optimal conditions, the soluble protein/total protein value was up to 18.35%, and compared with the predicted value 18.55% with regression equation, the relative error was 1.1%, illustrating that the model can rather precisely predict the soluble protein/total protein value. Under such conditions, the measured degree of hydrolysis was 15.84% and the protein of passing 0.45μm microfiltration mass ratio was 9.83%. The results show that the hydrolysis process could provide technical support for the production of fish sauce, bioactive peptides, amino acid and so on.

Key words：Collichthyslucidus; endogenous proteases; autohydrolyze; response surface methodology

DOI：10.3969/j.issn.1007-9580.2016.03.009

收稿日期：2016-03-05修回日期：2016-05-27

基金项目：江苏省苏北科技专项资金(富民强县)项目(BN2014053)

作者简介：刘汉文(1962— )，男，高级工程师，研究方向：水产品加工与贮藏。E-mail：liuhanwen@ycit.cn

中图分类号：TS 254.9

文献标志码：A

文章编号：1007-9580(2016)03-043-06