响应面法优化鱿鱼皮酶解工艺研究

钟　机， 金　红， 孙　鹤， 李惠芳， 陈丽娇

(福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002)



响应面法优化鱿鱼皮酶解工艺研究

钟机， 金红， 孙鹤， 李惠芳， 陈丽娇

(福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002)

摘要：为研究木瓜蛋白酶酶解鱿鱼皮的最佳酶解条件，通过单因素试验研究了酶添加量、酶解时间和酶解温度对鱿鱼皮水解度的影响。结果显示，3个因素对鱿鱼皮水解度均有不同程度的影响。在单因素试验的基础上，以水解度为响应值，酶添加量、酶解时间和酶解温度为自变量，采用Box-Benhnken响应面法设计3因素3水平优化试验，通过响应面分析，建立了二次多项数学模型对酶解条件进行优化，获得木瓜蛋白酶酶解鱿鱼皮的最佳条件：酶添加量4 560 U/g，酶解时间3.2 h和酶解温度50 ℃。在该条件下木瓜蛋白酶酶解鱿鱼皮的水解度可达15.53%，与模型预测值基本一致。研究表明，通过响应面法获得的数学预测模型能较好地预测木瓜蛋白酶酶解鱿鱼皮的效果，试验结果为鱿鱼加工副产物高值化利用提供了参考。

关键词：鱿鱼皮；水解度；酶解；响应面

鱿鱼(squid)是柔鱼、枪乌贼的俗称，属于软体动物门(Mollusca)、头足纲(Cephalopo-da)[1]。随着远洋捕捞技术的发展，近年来鱿鱼产量取得了巨大的增长。鱿鱼在加工过程中会产生大约35%的废弃物，包括头、内脏、皮、鳍、墨汁等，其中鱿鱼皮占了约8%～13%[2]。鱿鱼皮虽然作为加工废弃物，但却有极大的营养价值。据报道，鱿鱼皮中含有丰富的氨基酸、脂肪酸和矿物元素等，其中必需氨基酸占总氨基酸的30.97%，二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)占全部脂肪酸的50.44%[3]；鱿鱼皮鱼油中DHA占35.93%，EPA占14.93%，具有较高的营养价值[4]。

酶工程技术的发展和应用，为鱿鱼皮等废弃物的综合利用提供了新的加工途径。目前在水解动物蛋白研究中常用的商业蛋白酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等。相关研究成果包括：采用醋酸和胃蛋白酶相结合的方式提取秘鲁鱿鱼皮中的胶原蛋白[5]；采用胃蛋白酶制备鱿鱼皮明胶[6]；采用中性蛋白酶和复合蛋白酶对鱿鱼皮酶解[7]；采用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶分步水解鱿鱼皮制备胶原蛋白肽[8]；鱿鱼皮明胶水解物对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制活性及其降血压作用[9]；选择碱性蛋白酶作为水解用酶制备鱿鱼皮明胶肽[10]。可见鱿鱼皮蛋白酶解产物中具有特定的生理功能特性，具有广阔的应用前景。

在酶解过程中，蛋白酶的选择对酶解液的质量起着至关重要的作用。木瓜蛋白酶因具有原料丰富、价格低廉、热稳定性好等特点而具有较高的性价比，更加适合用于规模化工业生产。因此，为了研究木瓜蛋白酶酶解鱿鱼皮的最佳条件，本文以水解度为指标，通过响应面法对酶解条件进行优化试验，进而获得最佳酶解条件，为水产品加工企业提高资源的综合利用率提供理论参考。

1材料与方法

1.1材料、试剂与仪器设备

鱿鱼皮(近海鱿鱼，捕捞于福建闽东渔场)由福建坤兴海洋生物有限公司提供；木瓜蛋白酶购于Solarbio公司；甲醛、盐酸、氢氧化钠、硫酸等试剂均为分析纯。

仪器设备：K9840自动凯氏定氮仪(济南海能仪器股份有限公司)；Anke GL-20G-Ⅱ离心机(上海安亭科学仪器厂)；DK-S24电热恒温水浴锅(上海精宏试验设备有限公司)；BS 224S型电子分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；PB-10型pH计(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；SZF-06G 粗脂肪测定仪(上海新家仪器有限公司)。

1.2试验方法

1.2.1鱿鱼皮基本成分测定

将鱿鱼皮清洗去杂后剪碎(约1×1 cm)，再采用组织捣碎机处理2 min。鱿鱼皮中粗蛋白、粗脂肪、水分和灰分均采用常规方法测定[11]。

1.2.2鱿鱼皮酶解单因素试验

以水解度为指标，在其他因素固定不变的前提下，分别考察酶添加量(3 000、3 500、4 000、4 500、5 000 U/g)、酶解时间(1.5、2、2.5、3、3.5 h)和酶解温度(35、40、45、50、55 ℃)对鱿鱼皮水解度的影响。酶解结束后于95 ℃水浴锅中灭酶10 min，冷却至室温后离心(5 000 r/min)20 min，取上清液测水解度。进行3次平行试验，结果取其平均值。

1.2.3响应面法优化鱿鱼皮酶解工艺条件

为得到木瓜蛋白酶酶解鱿鱼皮的最佳酶解条件，根据单因素试验结果，以水解度为响应值，以酶添加量、酶解时间和酶解温度为自变量，采用Design-Expert 8.0软件对酶解条件进行优化试验设计及结果分析。试验因素水平编码如表1所示。

表1　响应面试验因素水平表

1.2.4水解度测定

水解度(DH)测定公式：

式中：C1—未水解时原料中的氨基态氮含量，g/100 mL；C2—酶解上清液氨基态氮含量，g/100 mL；C3—鱿鱼皮中总氮含量，g/100 g。氨氮含量参考文献[12]的测定方法，总氮含量采用凯氏定氮法测定。

2结果与分析

2.1鱿鱼皮基本组成

通过对鱿鱼皮基本组成成分的测定可知，粗蛋白含量为13.58%±0.03%，粗脂肪含量仅为1.56%±0.11%。林燕等[13]测得阿根廷鱿鱼皮的粗蛋白含量为14.54%±0.02%，粗脂肪含量为2.90%±0.17%；管娇雪等[3]测得秘鲁鱿鱼皮的粗蛋白含量为11.52%±0.35%，粗脂肪含量为0.73%±0.03%。鱿鱼品种及捕捞海域的不同是造成鱿鱼皮基本营养成分差异的主要原因。从整体上可以看出，鱿鱼皮是一种高蛋白低脂肪的加工副产物，具有极广的利用前景。

2.2单因素试验

2.2.1酶添加量对水解度的影响

在料液比为1∶3、酶解温度45 ℃、酶解时间3 h和自然pH条件下，考察酶添加量对水解度的影响，结果如图1所示。酶添加量对水解度的影响极显著(P<0.01)。当酶添加量为4 500 U/g时，水解度基本达到最大值，继续增加酶量对水解度的影响不显著(P>0.05)。这可能是当酶量添加到一定程度时，一方面底物已经基本被酶解完毕，另一方面酶浓度过高会使蛋白酶产生相互抑制作用，从而使酶解效率下降[14-15]。相关研究表明，当水解度达到一定程度时，并不会因为酶添加量的继续增加而出现显著变化[16]。对复合蛋白酶酶解鱿鱼皮条件优化表明，在一定条件下，当酶添加量为14 000 U/g时,水解度达20.7%，虽水解度较高，但其酶用量较多，不利于成本控制[13]。根据试验结果，选择4 500 U/g为最适酶添加量。

2.2.2酶解时间对水解度的影响

在料液比为1∶3，酶解温度45 ℃，酶添加量为4 500 U/g，自然pH条件下，研究酶解时间对水解度的影响，结果如图2所示。酶解时间对水解度的影响极显著(P<0.01)，酶解至3 h时水解度达最大的13.8%。出现该现象的原因可能是在酶解3 h后，蛋白酶作用已经基本完全发挥，并且在酶解过程中产生的多肽也会作为底物参与酶解反应[17-18]，进而降低酶解效率。刘振峰等[8]在一定条件下先用0.3%碱性蛋白酶酶解4 h，接着再用0.2%木瓜蛋白酶酶解2 h，最终使得鱿鱼皮胶原蛋白肽水解度达24.32%。不同的蛋白酶切位点不同，将多种蛋白酶配合使用，能起到较好的酶解效果，但该方法酶解时间较长，分步酶解也增加了实际操作过程中的不稳定性。根据试验结果，选择3 h为最适酶解时间。

图1　酶添加量对水解度的影响Fig.1　Effect of enzyme additive amount ondegree of hydrolysis

图2　酶解时间对水解度的影响Fig.2　Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis

2.2.3酶解温度对水解度的影响

在料液比为1∶3、酶添加量为4 500 U/g、酶解时间3 h和自然pH条件下，研究酶解温度对水解度的影响，结果如图3所示。酶解温度对水解度的影响极显著(P<0.01)，呈先上升后下降的趋势。当酶解温度为50 ℃时水解度达14.5%，继续升高温度，水解度呈下降趋势。原因可能是随着温度的升高，酶的活性逐渐升高，从而水解度升高；当温度过高时，蛋白酶结构发生变化，从而使酶解效率下降[19-20]。因此，根据试验结果，选择50 ℃为最适酶解温度。

图3　酶解温度对水解度的影响Fig.3　Effect of hydrolysis temperature ondegree of hydrolysis

2.3响应面优化试验

2.3.1响应面试验设计及结果分析

响应面试验设计及结果见表2。利用Design-Expert8.0软件对试验结果进行分析，得到以水解度为响应值的回归方程：

Y=15.50+0.95A+0.84B+0.21C-0.22AB-0.53AC-0.15BC-3.35A2-1.37B2-1.38C2

经分析，由该回归方程得到木瓜蛋白酶酶鱿鱼皮的最佳酶解条件为：酶添加量4 564.37 U/g，酶解时间3.15 h，酶解温度50.18 ℃，水解度预测值为15.687 5%。

表2　响应面试验设计及结果

回归模型方差分析结果见表3。由表3可知，该回归模型极显著(P< 0.000 1)；失拟项P=0.065 3>0.05，相关系数R2=0.993 8，说明该模型相关性较好，对实验的拟合度较高，表明可用该模型对水解度进行预测和分析。

由显著性分析可知，酶添加量和酶解时间对水解度的影响极显著，酶解温度对水解度的影响不显著；通过各因素间的交互作用可知，酶添加量和酶解温度的交互作用对水解度的影响极显著，其余交互作用不显著；各因素的二次项对水解度的影响均为极显著。再由表中F值可以看出，各因素对水解度影响的主次顺序为A>B>C，即酶添加量>酶解时间>酶解温度。

表3　回归模型方差分析表

注：*表示差异极显著(P<0.01)。

2.3.2响应面分析

图4为各因素交互作用对水解度影响的响应曲面图和等高线图。图中响应曲面越陡，说明该因素对响应值的影响越显著；由等高线图可知两因素交互作用对响应值的影响程度[21]。对比图4a～图4c各曲面的陡峭程度可知，酶添加量对水解度的影响最大，其次是酶解时间，酶解温度的影响最小。再由等高线图可知，图4b的等高线呈椭圆形，即酶添加量和酶解温度的交互作用对水解度的影响显著；图4a和图4c的等高线呈圆形，即交互作用对水解度的影响不显著，这与方差分析的结果一致。

2.4验证试验

为验证该模型回归方程的可靠性，对该模型预测得到的最佳酶解条件进行验证试验。考虑实际可操作性，对最优酶解条件进行略微调整：酶添加量4 560 U/g，酶解时间3.2 h，酶解温度50 ℃，进行3次平行试验，结果取其平均值，最终测得水解度为15.53%，与模型预测水解度误差为1.0%，与预测值基本一致，说明该模型能较好地预测水解度。

3结论

试验以鱿鱼皮为研究对象，木瓜蛋白酶为试验用酶，通过单因素试验研究了酶添加量、酶解时间和酶解温度对水解度的影响；在单因素试验的基础上，采用Box-Benhnken 响应面法优化木瓜蛋白酶酶解鱿鱼皮的工艺参数，建立了关于水解度的预测模型。结果表明，各因素对水解度的影响依次为：酶添加量>酶解时间>酶解温度；酶添加量和酶解温度的交互作用对水解度有显著影响；木瓜蛋白酶酶解鱿鱼皮的最佳酶解工艺为：酶添加量4 560 U/g，酶解时间3.2 h，酶解温度50 ℃，在该条件下测得水解度为15.53%，与模型预测值基本一致。

a 酶添加量与酶解时间的交互作用

b 酶添加量与酶解温度的交互作用

c 酶解时间与酶解温度的交互作用图4　各因素相互作用响应面与等高线图Fig.4　Response surface and contour plots showing the interactive effects of various factors on DH

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Optimization of hydrolysis conditions of squid skin by response surface methodology

ZHONG Ji， JIN Hong， SUN He， LI Huifang， CHEN Lijiao

(CollegeofFoodScience,FujianAgricultureandForestryUniversity,FujianFuzhou350002,China)

Abstract：To optimize the hydrolysis conditions of squid skin by papain, the effects of the papain dosage, hydrolysis time and hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis (DH) were studied by single factor experiment. The results showed that all the three factors exerted certain influences on the DH. Then the Box-Benhnken response surface methods were performed, taking the dosage of protease, contact time and hydrolysis temperature as independent variables to the DH for its optimal response value. Through the response surface analysis, a quadratic polynomial mathematical model was established to optimize the hydrolysis conditions, and the optimal hydrolysis conditions were obtained as follows：dosage of protease should be 4560 U/g, hydrolysis time 3.2 h and hydrolysis temperature 50 ℃. Under these optimal conditions, the DH could reach up to 15.53%, which was basically consist with the predicted value by the model. The research shows that, the mathematical model obtained through response surface method can rather precisely predict the hydrolysis effect of papain for squid skin, and the research results provide reference for improving the utilization rate of by-products from squid processing.

Key words：squid skin; degree of hydrolysis; hydrolysis; response surface method

DOI：10.3969/j.issn.1007-9580.2016.03.010

收稿日期：2016-03-24修回日期：2016-05-19

基金项目：福建省福建农林大学高水平大学建设项目“海洋动物蛋白的深加工(61201404320)”

作者简介：钟机(1990—)，男，硕士研究生，研究方向：农产品加工技术。E-mail：zhongjilb@163.com 通信作者：陈丽娇(1962—)，女，教授，硕士生导师，研究方向：水产品精深加工及综合利用。E-mail：chenlijao@126.com

中图分类号：TS254.4

文献标志码：A

文章编号：1007-9580(2016)03-049-06