产纤维素酶解淀粉芽胞杆菌分离株的生物学特性研究

尹珺伊，候美如，王　岩，刘　宇，周庆民，秦平伟，史同瑞

(黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔 161006)



产纤维素酶解淀粉芽胞杆菌分离株的生物学特性研究

尹珺伊，候美如，王岩，刘宇，周庆民，秦平伟，史同瑞*

(黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔 161006)

摘要：对发酵黄芪样品中分离的1株产纤维素酶解淀粉芽胞杆菌的生物学特性进行了检测，试验结果表明，菌株在10℃～60℃环境均能生长，最适生长温度为35℃～40℃。pH5.0～8.0培养基均适宜菌株生长，其中最适pH为6.0。在37℃环境200 r/min振荡培养的生长曲线在0～4 h为延迟期，4 h～12 h为对数期，12 h～24 h为稳定期，24 h以后为衰亡期。细菌37℃培养32 h开始产生芽胞，在培养72 h时芽胞形成率达到80.67%。菌株对多数抗菌药物敏感，且安全性良好。该菌株适应性强，生长条件较为宽松，这为其开发应用提供了依据。

关键词：产纤维素酶；解淀粉芽胞杆菌；生物学特性

解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)是一种与枯草芽胞杆菌亲缘性很高的细菌，自然界中分布广泛[1]。解淀粉芽胞杆菌易生长，抗逆性强，在其生长过程中能够产生抑菌活性物质和多种酶类，因此该菌不仅可用于动物疾病的防治，而且还能促进动物生长，提高生产性能，是一种较为理想的微生态菌[2]。近年来，随着解淀粉芽胞杆菌研究的深入，解淀粉芽胞杆菌的应用前景更加广阔。最近，作者从发酵黄芪的样品中分离鉴定出1株产纤维素酶的解淀粉芽胞杆菌，并对其纤维素酶学性质进行了分析。本文研究了该菌的生物学特性，旨在为其发酵黄芪工艺优化及其制剂的应用提供技术支撑。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株与实验动物产纤维素酶解淀粉芽胞杆菌菌株由本研究室分离保存；健康小鼠，体重19 g～21 g，雌雄兼有，由齐齐哈尔医学院实验动物中心惠赠。

1.1.2试剂与仪器微量生化反应鉴定管、药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司；UV-5900紫外可见分光光度计，购自上海元析仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1形态观察及生化试验取在37℃环境培养16、18、24、48和72 h的解淀粉芽胞杆菌菌液，涂片，革兰染色，镜检菌体形态。取菌种接种营养肉汤和营养琼脂平板，分别置于有氧和厌氧条件下在37℃环境培养24 h、48 h和72 h，观察菌株培养特性及嗜氧性。取培养18 h～20 h菌液接种生化管置37℃环境培养，测定细菌生化特性。

1.2.2适宜生长温度测定取解淀粉芽胞杆菌菌株18 h～20 h培养液，调整菌液浓度为1.0×106CFU/mL。以1%接种量接种营养肉汤，分别置温度为10、20、30、35、40、45、50、60、70℃环境以200 r/min振荡培养。参照文献方法[3]，在培养18、24、42 h取样，以无菌营养肉汤作空白对照，于波长600 nm处测定各培养温度下菌株培养液的OD值。以培养温度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制菌液含菌量柱形图，比较细菌生长情况。试验设3个重复。

1.2.3适宜生长酸碱度测定取1.2.2调整菌液，以1%接种量接种pH分别为2、3、4、5、6、7、8、9的营养肉汤，置37℃以200 r/min振荡培养,18、24、42 h取样，于波长600 nm处测定各pH条件下菌株培养液的OD值。以无菌营养肉汤作空白对照，以pH为横坐标，OD值为纵坐标，绘制菌液含菌量柱形图。试验设3个重复。

1.2.4菌株生长曲线测定取1.2.2调整菌液，以1%接种量接种营养肉汤，置37℃以200 r/min振荡培养，在培养4、8、12、16、20、24、30、36、42、48、56、72、80、96 h取样，于波长600 nm处测定不同培养时间菌株培养液的OD值。以无菌营养肉汤作空白对照，以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制细菌生长曲线。试验设3个重复。

1.2.5芽胞形成情况测定参照文献方法[4]，取培养16、20、24、48、64、72 h的菌液，作10倍连续稀释。用无菌移液管分别取108、109、1010共3个稀释度的稀释菌液0.1 mL，涂布接种于营养琼脂平板培养，计数细菌数。剩余稀释菌液置80℃水浴处理10 min～15 min，无菌吸取0.1 mL处理菌液，接种营养琼脂平板培养，计数芽胞形成率。芽胞形成率(%)=(形成芽胞的菌数/总菌数)×100%。

1.2.6药敏试验应用KB法测定菌株的药物敏感性。取菌株接种MH肉汤，37℃培养16 h～20 h，用MH肉汤调整菌液浓度至0.5号麦氏标准管浊度，然后接种MH琼脂平板，贴上药敏片，置37℃培养16 h～18 h，测定抑菌圈直径，依据药敏片判定标准判定细菌的药物敏感性。

1.2.7安全性试验选用健康小鼠20只，随机均分4组，雌雄各半。Ⅰ组灌服菌液，Ⅱ组腹腔注射菌液，Ⅲ组灌服生理盐水，Ⅳ组腹腔注射生理盐水。灌服剂量为0.5 mL/只，2次/d，连续灌服7 d。注射剂量为一次性注射0.3 mL/只。试验菌液为菌株18 h～24 h肉汤培养物，菌液浓度约为36×108CFU/mL。每天观察记录小鼠临床表现，死亡鼠剖检，观察2周后处死全部存活小鼠，剖检内脏器官有无异常变化。

2结果

2.1菌株形态及生化特性

菌株为革兰阳性大杆菌，两端钝圆，多单在。老龄菌变长，多呈短链状排列。细菌形成中生或次端生芽胞，芽胞椭圆形，芽胞直径不大于菌体(图1)。

图1　菌株形态(1 000×)

菌株为兼性厌氧菌，在营养琼脂培养24 h，形成灰白色、干燥、不透明的大菌落，菌落表面粗糙，有褶皱，边缘不规则，有扩散。营养肉汤静置培养24 h，肉汤澄清，不产生沉淀，肉汤表面形成灰白色菌膜。

菌株分解葡萄糖、蔗糖，不发酵乳糖、麦芽糖、果糖、木糖、覃糖、山梨醇、甘露醇和水杨苷，水解七叶苷，H2S、VP、吲哚试验阳性，尿素酶、枸橼酸盐、甲基红试验阴性。

2.2温度对菌株生长的影响

试验结果表明，菌株在环境温度10℃～60℃均能生长，其中适宜生长温度为30℃～40℃，最适生长温度为35℃～40℃。在10℃～40℃范围内，随着培养温度的升高菌株培养液的OD值逐渐增大，至40℃达到峰值，但35℃与40℃菌液OD值差异不显著(P>0.05)。当培养温度大于40℃时，菌株培养液的OD值逐渐降低，当培养温度升至60℃时，菌株培养液的OD值最低(图2)。

图2　温度对菌株生长影响

2.3酸碱度对菌株生长的影响

试验结果表明，在pH5.0～8.0的培养基均适宜菌株生长，其中最适pH为6.0。培养基pH为2～4时，菌株培养液的OD值较小，培养基不适宜菌株生长。当培养基pH升至5时，菌液OD值陡然上升。培养基pH升至6时，菌株培养液的OD值达到峰值。培养基pH升至9时，菌液OD值降为0(图3)。

图3　pH对菌株生长影响

2.4菌株生长曲线及芽胞形成情况

菌株在37℃环境200 r/min振荡培养，其生长曲线为：0～4 h为生长延迟期，4 h～12 h为对数生长期，12 h～24 h为稳定期，24 h以后为衰亡期(图4)。细菌37℃培养32 h开始产生芽胞，且芽胞数量随着培养时间的延长而增多，在培养72 h时芽胞形成率达到80.67%(图5)。

图4　菌株生长曲线

图5　菌株芽胞形成情况

2.5菌株药物敏感性

药敏试验结果表明，在测定的14种常用药物中，除林可霉素耐药外，对其他13种药物均敏感,见表1。

表1　药敏试验结果(n=3)

注：“R”耐药；“I”中介；“S”敏感。

Note："R"resistance;"I"intermedium；"S"sensitive.

2.6菌株安全性

试验鼠观察2周均健活，临床未见异常症状。对小鼠进行剖检，组织脏器未见病理变化。试验结果表明，菌株安全性良好。

3讨论

本试验解淀粉芽胞杆菌菌株仅发酵葡萄糖和蔗糖，对多数糖和醇均不发酵。参照文献[5]模式菌株的生化特性，分离菌株具有与解淀粉芽胞杆菌模式菌相近的生化特性。这与刘亚楠等[6]、朱芝秀等[7]报道相近，而与陈成等[8]、王德培等[9]和曹海鹏等[10]报道存在较大差异。药敏试验结果表明，菌株对多数抗生素均高度敏感，因此在该菌株发酵与应用过程中应避免与抗菌药物的混合使用。

本试验菌株在环境温度10℃～60℃范围内均能生长，其中适宜生长温度为30℃～40℃，最适生长温度为35℃～40℃。这与一些学者报道的适宜生长温度为28℃～38℃基本一致[3,10-13]。试验菌株在pH5.0～8.0环境适宜生长，较适宜pH为6.0，这与车晓曦等[11]报道一致，但低于戴秀华等[3]、曹海鹏等[10]、孙镇平等[12]等报道的适宜pH7.0～7.2。

试验菌株的生长延迟期为培养0～4 h，对数生长期为4 h～12 h，稳定期为12 h～24 h。试验菌株生长曲线与权春善等[11]、单哲等[13]报道基本一致。但与戴秀华等[3]、曹海鹏等[10]报道有一定差异。试验菌株在培养32 h后开始产芽胞，且芽胞数量随时间增加，在培养72 h时芽胞含量达到80.67%，芽胞形成时间与戴秀华等[3]报道基本一致，但72 h时芽胞形成率低于其报道的95%。细菌的生长与培养条件有关，而芽胞形成也受碳源、氮源、金属离子浓度，以及培养温度和溶氧等因素的影响，因此，本试验采用的培养基、培养温度、摇床培养等条件可能是造成与其他学者报道结果不一致的原因。

试验菌株在pH5.0～8.0、环境温度30℃～40℃范围内均能较好生长，且在培养32 h后开始产生芽胞，说明该菌适应性强，生长条件较为宽松，这为该菌的发酵和利用提供了便利。黄芪具有保健抗病及提高生产性能作用[14]，发酵黄芪较黄芪微粉更具优势，本试验也为解淀粉芽胞杆菌分离菌株发酵黄芪制剂的开发应用奠定了一定的技术基础。

参考文献：

[1]张娟，杨彩梅，曹广添，等.解淀粉芽胞杆菌及其作为益生菌的应用[J].动物营养学报，2014，26(4)：863-867.

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[4]朱芝秀，蒋新华，邓舜洲，等.解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其对嗜水气单胞菌抑制作用研究[J].中国畜牧兽医，2015，42(3)：734-740.

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[6]刘亚楠，习丙文，梁利国，等.1株嗜水气单胞菌的拮抗菌鉴定及其特性研究[J].水生态学杂志，2014，35(3)：82-87.

[7]朱芝秀，蒋新华，舜洲，等.解淀粉芽胞杆菌的分离鉴定及其对嗜水气单胞菌抑制作用研究[J].中国畜牧兽医，2015，42(3)：734-740.

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[10]曹海鹏，何珊，刘丽玲，等.鲟源病原性嗜水气单胞菌拮抗芽胞杆菌的鉴定及其生物学特性[J].微生物学通报，2011，38(9)：1377?1378.

[11]车晓曦，李社增，李校.一株解淀粉芽胞杆菌发酵培养基的设计及发酵条件的优化[J].安徽农业科学，2010，38(18)：9402-9405.

[12]孙镇平，刘洪红，王忠敏，等.解淀粉芽胞杆菌固体培养条件的研究[J].扬州大学学报(农业与生命科学版)究，2014，35(1)：27-30.

[13]单哲，李敬盼，孙镇平，等.解淀粉芽胞杆菌液体发酵动态变化规律的研究[J].饲料研究，2015，7：65-69.

[14]孙波，陈静，刘江，等.黄芪多糖在动物饲料添加剂与免疫增强剂中的应用[J].动物医学进展，2014，35(7)：111-114.

Study on Biological Characteristics of Cellulase-producingBacillusamyloliquefaciens

YIN Jun-yi,HOU Mei-ru，WANG Yan，LIU Yu，ZHOU Qing-ming，QIN Ping-wei，SHI Tong-rui

(HeilongjiangInstituteofVeterinaryMedicine，Qiqihaer，Heilongjiang，161006，China)

Abstract:The biological characteristics of cellulase-producingBacillusamyloliquefaciensisolated from fermentedAstragalussamples were tested in this study. The results showed that the strain could grow at the temperature of 10℃-60℃, and the optimum growth temperature was 35℃-40℃. The strains were able to grow well at a pH range of 5.0-8.0， and the optimum pH was 6.0. Under the condition of shaking culture at 37℃ in the speed of 200 r/min, the growth curve revealed that 0-4 h was lag phase, 4 h-12 h was logarithmic phase, 12 h-24 h was stationary phase, decline phase started after 24 h. It began to form spore after culture for 32 h, and the sporulation rate could reach 80.67% after 72 h. This strain is sensitive to most of antimicrobial drugs, and has good security. The well-adapted character and its loose growth conditions provided basis for its further development and application.

Key words:cellulase;Bacillusamyloliquefaciens; biological characteristics

收稿日期：2015-12-05

基金项目：黑龙江科技计划项目(GC13B404)

作者简介：尹珺伊(1987-)，女，黑龙江齐齐哈尔人，实习研究员，硕士研究生，主要从事兽医微生物学研究。*通讯作者

中图分类号:S852.616

文献标识码:A

文章编号:1007-5038(2016)06-0045-04