小反刍兽疫疫苗临床免疫效果试验

宋跃君，徐　玉，张远洲，刘　洪，张照宇，唐小明，林　源，王卫国，鲁杏华，邱立新， 何世成，王昌建*

(1.湖南省动物疫病预防控制中心，湖南长沙 410014；2.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410128；3.张家界市动物疫病预防控制中心，湖南张家界 427100；4.慈利县畜牧水产局，湖南慈利 427200)



小反刍兽疫疫苗临床免疫效果试验

宋跃君1，徐玉2，张远洲3，刘洪4，张照宇4，唐小明1，林源1，王卫国1，鲁杏华1，邱立新1， 何世成1，王昌建1*

(1.湖南省动物疫病预防控制中心，湖南长沙 410014；2.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410128；3.张家界市动物疫病预防控制中心，湖南张家界 427100；4.慈利县畜牧水产局，湖南慈利 427200)

摘要：为评估小反刍兽疫弱毒活疫苗(75/1 株)的临床免疫效果，通过免疫试验、免疫场的跟踪检测以及荧光RT-PCR检测方法，对疫苗免疫安全性、免疫抗体持续期、抗体效价消长情况进行了临床免疫测试和评估。结果显示，疫苗免疫安全性良好，免疫后14 d可以检测到疫苗核酸，免疫后7 d开始产生特异性抗体，抗体持续时间达12个月以上。研究表明临床用小反刍兽疫疫苗具有良好的免疫原性，可产生良好的临床免疫效果。

关键词：小反刍兽疫疫苗；免疫效果；抗体；病原核酸检测

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)又称小反刍兽假性牛瘟、肺肠炎、口炎肺肠炎综合征等，是由副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbolivirus)的小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的一种烈性、高度接触性传染病，主要感染小反刍兽，山羊和绵羊高度易感，野生动物也偶有感染。该病是我国的一类动物疫病，OIE规定疫情必须上报[1-2]。1942年该病首次报道发现于非洲西部的象牙海岸，随后10多年几乎传遍了从撒哈拉沙漠到赤道的所有国家，由西非、中非和东非向东扩散，目前已传播到西亚和南亚地区，且有上升趋势。截至2003 年8 月，我国周边国家包括老挝、尼泊尔、印度、孟加拉国、俄罗斯、巴基斯坦和缅甸等国均暴发过大规模小反刍兽疫疫情。2007年该病首次传入我国西藏自治区日土县，证实为境外输入疫情[3]。2013年再次传入，2014年在我国大范围暴发，自首次发生以来一直呈扩大趋势，成为了严重危害畜牧业生产安全的重大跨国动物疫病之一[4]。目前，肯尼亚、索马里等非洲国家，印度、巴基斯坦等亚洲国家仍遭受小反刍兽疫带来的巨大经济损失[5]。2014 年我国农业部共发布小反刍兽疫疫情260 起，涉及21 个省份，给我国养羊业造成了巨大的损失[6]。

为准确评估小反刍兽疫疫苗临床免疫效果，结合临床免疫试验和免疫场的回顾性检测，研究了小反刍兽疫活疫苗的临床免疫效果，现将结果报告如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1疫苗小反刍兽疫活疫苗，新疆天康畜牧生物技术股份有限公司生产(批号：2015001-2)。试验用疫苗取自湖南省慈利县疫苗储备库。

1.1.2试验羊场临床免疫试验羊场为张家界市慈利县岩洛村李氏养羊场，存栏羊约120头，该场位于山间，天然防疫屏障良好，饲养的本地山羊为山地放养，场主饲养经验丰富，防疫、管理意识较强；免疫调查试验样品来源于常德、张家界等地区的免疫场。

1.1.3检测试剂小反刍兽疫抗体检测试剂盒(ID Screen®PPR Competition，批号：757)购自法国ID-VET；小反刍兽疫荧光RT-PCR检测试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司(批号：20141020)。

1.2方法

1.2.1免疫试验对25头2～3月龄试验羊进行疫苗免疫，同时选5头2～3月龄羊作为空白对照组，试验组用兽用耳标和塑料小标签系颈部进行双重标记。免疫前，逐头采集试验组和空白对照组羊的血清和眼拭子、鼻拭子、肛门拭子等样品；采样后，试验组每头羊颈后皮下注射试验疫苗1头份，空白对照组不免疫。免疫接种后连续7 d，对试验动物进行临床观察记录；同时于免疫接种后1、3、5、7、14、21、28、56、84、112、145 d进行采样，试验组与空白对照组分别全部采集血清和拭子(拭子样品采集至免疫后28 d)，每头羊的眼拭子、鼻拭子、肛门拭子对应分3管保存。

1.2.2疫苗安全性试验对5头6月龄未免疫山羊进行10头份PPRV疫苗免疫接种，免疫接种后连续7 d，观察记录试验动物的免疫反应。

1.2.3免疫抗体持续期评估筛选免疫操作技术规范、免疫记录清晰的规模羊场75个为免疫场，每场采集免疫羊血清10份～20份；其中，在36个免疫场内采集到免疫后6个月的羊血清465份，在39个免疫场采集到免疫后12个月的羊血清435份。检测PPRV抗体，结合免疫试验结果，评估疫苗免疫后抗体的持续时间。

1.2.4实验室检测用法国ID-VET生产的ID Screen®PPR Competition 小反刍兽疫抗体检测试剂盒检测血清中的PPRV抗体(竞争ELISA法,S/N值≤50%为阳性)，用北京世纪元亨动物防疫技术有限公司小反刍兽疫荧光RT-PCR检测试剂盒检测血清、拭子中的PPRV核酸，按说明书进行操作。

2结果

2.1免疫副反应结果

1头份免疫试验羊、10头份免疫试验羊免疫接种后均未见免疫副反应，连续观察7 d，试验羊精神状态良好，食欲及生长发育正常。

2.2免疫试验血清抗体检测结果

免疫接种后，抗体消长曲线明显，免疫接种后第7天产生抗体，群体抗体合格率迅速上升至92%，免疫接种后第14天群体阳性率达100%，未免疫组抗体阳性率持续为0；各检测点抗体效价(S/N%值)群体均一性好，变异系数低，平均值为0.21。免疫前后羊血清小反刍兽疫疫苗抗体效价消长曲线见图1，群体阳性率结果见图2。

2.3试验动物病原核酸检测结果

荧光RT-PCR操作简便，敏感性比普通RT-PCR高，逐渐受到青睐[7]。对免疫接种前和免疫接种后1、3、5、7、14、21、28 d的鼻、眼、肛门拭子以及血清样品进行PPRV核酸检测。结果显示，免疫接种后14 d的羊群中检测出1份羊肛门拭子样品PRRV核酸阳性，阳性率为4%(1/25)，其余样品均为阴性，试验羊免疫接种前后PPRV核酸检测结果见表1。

2.4免疫抗体持续期评估

36个免疫场收集的465份免疫后6个月的血清抗体阳性率为83.2%，39个免疫场收集的435份免疫后12个月的血清抗体阳性率为90.3%(表2)；结合免疫试验的结果，PPRV疫苗免疫后，第7天可产生群体保护，抗体持续期至少可维持12个月。

图1　小反刍兽疫疫苗免疫试验抗体效价消长曲线图

图2　小反刍兽疫疫苗免疫试验抗体阳性率曲线图

3讨论

本次试验，所有免疫动物免疫接种后均未出现明显的免疫副反应，表明试验疫苗具有良好的临床免疫安全性。 免疫试验结果显示，羊群免疫接种疫苗后，前5 d未检测到抗体阳性，第7天抗体阳性率迅速上升至92%，免疫接种后14 d抗体阳性率可达100%，免疫组平均变异系数为0.21，抗体产生迅速，均一性高，表明试验疫苗具有良好的免疫原性，试验结果优于何利昆等人的研究报道[8]。

为更好的评估免疫后抗体的持续期，本试验采用临床免疫和免疫场监测相结合的方式评估免疫抗体持续期，结果显示，小反刍兽疫疫苗抗体持续期在12个月以上，这与印春生、薛青红等人的评估结果一致[2,9]。

表1　PPRV核酸学检测结果

注：阳性数/样品数。

Note:Positive numbers/samples.

表2　免疫场免疫持续期检测结果明细表

弱毒疫苗Nigeria75/1是OIE规定的唯一允许使用的PPRV疫苗,在我国，新疆天康畜牧生物技术股份有限公司于2007年10月份开始批量生产小反刍兽疫弱毒活疫苗(75/1 株)并用于全国PPR疫情防控[10]。由于生产厂家唯一，临床流通疫苗的质量是否持续符合防疫要求是人们迫切关注的问题，本研究结果表明，随机取自县级疫苗储备库中的疫苗免疫效果良好。

参考文献：

[1]张晶霞，杜容芳.动物小反刍兽疫的流行、诊断与防控[J].养殖技术顾问，2014(12)：108.

[2]薛青红，印春生，李宁，等.小反刍兽疫活疫苗效力评价[J].中国兽医学报，2011，31(9)：1276-1278.

[3]周艳君，田峰，彭伏虎，等.湖北省首例山羊小反刍兽疫疫情诊断[J].湖北畜牧兽医，2014，35(10)： 17-18.

[4]龙云凤，刘晓慧，周晓黎，等.小反刍兽疫流行病学及防控研究进展[J].动物医学进展，2012，33(5)：94-98.

[5] Banyard AC，Parida S，Batten C，et al.Global distribution of peste des petits ruminants virus and prospects for improved diagnosis and control[J].J Gen Virol，2010，91(Pt 12)：2885-2897.

[6]王昌建，林源，何世成，等.湖南省小反刍兽疫防控措施及评估[J].畜牧兽医科技信息，2015(7)：19-20.

[7]徐琼，何宇乾，吴海燕，等.小反刍兽疫研究进展[J].动物医学进展，2012，33(8)：93-96.

[8]何利昆，段亚良，谷志大，等.辽宁省小反刍兽疫疫苗临床免疫效果跟踪试验及抗体水平动态观察[J].现代畜牧兽医，2014(8)：14-18.

[9]印春生，支海兵，王乐元，等.小反刍兽疫活疫苗临床试验研究[J].中国兽药杂志，2010，44(7)：1-5.

[10]姜晓东，邵明旭，朱瑞良.规模化羊场小反刍兽疫的诊断与防控[J].山东畜牧兽医，2014，35(10)： 38-39.

Clinical Immune Effect of Peste Des Petits Ruminants Vaccine

SONG Yue-jun1,XU Yu2,ZHANG Yuan-zhou3,LIU Hong4,ZHANG Zhao-yu4,TANG Xiao-ming1,LIN Yuan1,WANG Wei-guo1,LU Xing-hua1,QIU Li-xin1,HE Shi-cheng1,WANG Chang-jian1

(1.HunanCenterforAnimalDiseasePreventionandControl,Changsha,Hunan,410014,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan,410128,China;3.ZhangjiajieCenterforAnimalDiseasePreventionandControl,Zhangjiajie,Hunan,427100,China;4.CiliCountyAnimalHusbandryandAquacultureAdministration,Cili,Hunan,427200,China)

Abstract:In order to assess the clinical immune effect of peste des petits ruminants attenuated live vaccine (75/1),the vaccines immune safety,immune antibody duration,growth and decline of the antibody titers were tested and evaluated by immune experiments,immune farm tracking detection and fluorescent RT-PCR method.The results showed that the vaccine nucleic acids can be detected 14 days after immunization, specific antibodies can be detected 7 days after immunization,and the duration of the antibody exceeds more than 12 months.Research showed that the peste des petits ruminants vaccine for clinical use has good immunogenicity,can produce good clinical immune effect.

Key words:Peste des petits ruminants vaccine；immune effect;antibody；pathogen detection

收稿日期：2015-12-12

作者简介：宋跃君(1961-)女，湖南浏阳人，高级兽医师，主要从事动物疫病防控工作。*通讯作者

中图分类号:S852.659.5

文献标识码:A

文章编号:1007-5038(2016)06-0077-03