坏死梭杆菌外膜蛋白提取及免疫原性分析

徐　晶，陈立志，刘晓颖，冯二凯

(1. 齐齐哈尔医学院生化教研室，黑龙江齐齐哈尔 161006；2. 中国农业科学院特产研究所 吉林省部共建特种经济动物分子生物学国家重点实验室，吉林长春 130112)



坏死梭杆菌外膜蛋白提取及免疫原性分析

徐晶1，陈立志2*，刘晓颖2，冯二凯2

(1. 齐齐哈尔医学院生化教研室，黑龙江齐齐哈尔 161006；2. 中国农业科学院特产研究所 吉林省部共建特种经济动物分子生物学国家重点实验室，吉林长春 130112)

摘要：从坏死梭杆菌(Fusobacteriumnecrophorum，FN)中提取外膜蛋白(outer membrane protein, OMP)并分析免疫原性。采用无菌心脑浸液(BHI)肉汤培养基培养坏死梭杆菌,用20 mmol/L HEPEs-LiCl缓冲液提取外膜蛋白，经SDS-PAGE、Western blot和接种小鼠病理学检测分析表明，具有唯一条带，分子质量为44.5 ku，具有良好的免疫活性并有一定毒性，研究结果为坏死梭杆菌亚单位疫苗研制奠定了基础。

关键词：坏死梭杆菌；外膜蛋白；提取；免疫活性

坏死梭杆菌(Fusobacteriumnecrophorum，FN)是引起动物肝脓肿、腐蹄病[1]、坏死性喉炎的主要病原菌，也是寄生在肠道、黏膜及口腔的重要人畜共患病原菌。坏死梭杆菌常引起人类咽炎、颈淋巴结肿大、颈内静脉的单侧血栓性静脉炎、急性扁桃体炎和扁桃体周围囊肿[2-5]，甚至感染人的头部和颈部[6]，严重影响人类健康和生活质量。研究坏死梭杆菌的毒力因子，是控制和预防坏死杆菌病发生与发展的重点。近年来，多种病原菌的外膜蛋白(OMP)已成为研究的热点问题[7-11]，OMP具有较好的免疫活性，本研究提取坏死梭杆菌主要外膜蛋白，为坏死梭杆菌亚单位疫苗的研制奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂心脑浸液(brain Heart Infusion，BHI)为BD Difco公司产品；维生素C(Vc)为Scientific Research Special公司产品；十二烷基肌氨酸钠(SLS)和十二烷基硫酸锂(LDS)为上海一基生物科技有限公司产品；HEPEs为北京华美生物工程有限公司产品；蛋白质分子质量标准为宝生物工程(大连)有限公司产品；考马斯亮蓝R-250为Sigma公司产品；Goat-anti-Rabbit IgG (H&L)、DAB显色试剂盒为北京中杉金桥生物技术公司产品；苏木精-伊红紫色液、苏木精染色液和伊红染色液为厦门迈威生物科技有限公司产品。

1.1.2菌种坏死梭杆菌(Fusobacteriumnecrophorum, FN)AB型菌株，为中国农业科学院特产研究所分离鉴定及保存的毒力菌株。

1.2方法

1.2.1菌种复苏将冻存的坏死梭杆菌(AB)，冷水浴解冻，取2 mL～3 mL接种于10 mL新鲜无菌BHI液体培养基中，将试管放入置于37℃恒温培养箱的厌氧罐中约48 h恢复菌株活力，再接种到新的培养基继续培养24 h，重复此操作1～2次；选择生长良好的菌液按1∶30～1∶50的比例传到400 mL BHI液体培养基(用液体石蜡封面)中，用封口膜封好瓶口置37℃恒温箱中培养24 h。

1.2.2 OMP提取离心收集菌沉淀(4℃，6 000 r/min，20 min)，用0.8 g/L的生理盐水清洗3次；每200 mL培养基细菌沉淀用10 mL PBS(pH 7.4)重悬，520 W冰上超声波破碎(破碎时间6 s，间歇时间6 s，约200次)；轻微离心(4℃，1 000 r/min，30 min)去除沉淀中的细胞壁及未破碎细胞，获取上清；4℃、15 000 r/min 30 min，弃上清，获取沉淀；将沉淀用20 mL 5 g/L的SLS重悬沉淀，25℃，孵育30 min，除去细胞内膜蛋白；4℃、15 000 r/min离心30 min，弃上清，获取沉淀；将沉淀用20 mL 20 g/L LDS的20 mmol/L HEPEs-LiCl重悬，用NaOH微调pH为7.4，4℃孵育10 min；4℃、15 000 r/min 离心3 h，弃上清，获取沉淀；将沉淀用5 mL 20 mmol/L HEPEs重悬；分装100 μL，置-80℃保存。

1.2.3OMP含量测定将上述制备的蛋白样品用20 mmol/L HEPEs缓冲液稀释20倍，HEPEs做空白对照，将空白组和待测组加入到石英比色皿中，调零后分别读取OD280 nm和OD260 nm的值，按照如下公式计算蛋白浓度。

蛋白质浓度(mg/mL)=(1.45×OD280-0.74×OD260)× 稀释倍数

1.2.4Western blot鉴定SDS-PAGE电泳，采用半干转印法转移到硝酸纤维素膜(NC)上，50 g/L脱脂奶粉的TBS/T 4℃封闭过夜。一抗为兔抗F.necrophrum(AB)血清(1：50)，二抗为山羊抗Goat-anti-rabbit IgG (1∶4 000)，DAB显色检测。

1.2.5小鼠病理学检测分别取小鼠腹腔内接种HEPEs(对照组)和坏死梭杆菌OMP(试验组)的肝脏，冷冻切片，进行病理组织学检测，按以下操作进行。

①前处理。将冷冻切片机预冷至-20℃，新的载玻片和盖玻片用750 mL/L乙醇浸泡过夜，待干燥后备用。②切片。从-80℃取出待检测样品置于冷冻头上，固定液将其固定，设置厚度为10 μm，调整好切片角度，连续切取至载玻片上，做好记录。③固定。Carnoy固定液固定0.5 min。④苏木精染色。将片子置于苏木精中染色8 min，随后用蒸馏水冲洗3次。⑤分化。将片子置于10 mL/L盐酸乙醇中进行分化，4 min。⑥返蓝。10 mL/L氨水返蓝1 min。⑦伊红染色。置于伊红染色液中1 min。⑧梯度酒精脱色。将片子分别置于800 mL/L、950 mL/L、无水乙醇Ⅰ和无水乙醇Ⅱ，30 s、30 s、3 min和3 min。⑨二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ，分别处理3 min。

2结果

2.1菌种的复苏

接种坏死梭杆菌的BHI培养基混浊，乳白色，带有微弱的臭味。革兰染色检测结果显示坏死梭杆菌为革兰阴性菌，呈短杆状或球杆状(图1)。

2.2SDS-PAGE鉴定

SDS-PAGE鉴定,坏死梭杆菌OMP分子质量大小为44.5 ku，经考马斯亮蓝R-250染色，大约在44.5 ku出现一条清晰可见的条带(图2)。

2.3Western blot分析

Western blot分析，在44.5 ku处出现条带，表明该提取物具有反应原性(图3)。

2.4OMP含量

OMP粗提物经20 mmol/L HEPEs 20倍稀释，分光度计读取OD260 nm和OD280 nm值(表1)。经计算,蛋白质浓度(mg/mL)=(1.45×OD280-

0.74×OD260)×稀释倍数，计算结果OMP粗提的平均值是4.524 mg/mL。

2.5肝脏病理组织学检测

病理切片在显微镜下观察，发现空白组组织无异常表现(图4)。粗提取的OMP组肝细胞出现坏死点(图5)。

图1坏死梭杆菌的革兰染色(100×)

Fig.1Gram staining ofF.necrophorum(100×)

M. 蛋白分子质量标准；1.OMP粗提物

M.Protein molecular weight Marker; 1.Crude extract of OMP

图2OMP的SDS-PAGE鉴定

Fig.2Identification of OMP by SDS-PAGE

1.OMP粗提物；M.蛋白分子质量标准

1.Crude extract of OMP; M.Protein molecular weight Marker

图3OMP的Western blot分析

Fig.3Analysis of OMP by Western blot

表1　不同组OMP粗提物的OD260 nm和OD280 nm检测结果

图4小鼠病理切片检测对照组

Fig.4Histopathological section of mouse in control group

图5小鼠病理切片检测试验组

Fig.5Histopathological section of mouse in experimental group

3讨论

近年来，坏死梭杆菌引起的坏死杆菌病给畜牧业造成严重的经济损失，免疫接种疫苗是预防坏死梭杆菌感染的主要措施，疫苗的有效成分将成为我们关注的焦点。近年来，外膜蛋白在免疫方面的作用备受关注，OMP是存在于细胞外膜间及其有关的蛋白质[12]，直接与外界接触。Shen J等[13]发现编码外膜蛋白OprD2基因突变或片段缺失，导致外膜蛋白OprD2缺失，将使铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药；Kumar A等[14-15]研究发现坏死梭杆菌42.5 ku OMP介导该细菌高亲的粘附在牛内皮细胞，引起牛肝脏脓肿性病变；Sun D等[16]研究证实坏死梭杆菌外膜蛋白与其他细菌外膜蛋白序列相似，系统发育分析表明坏死梭杆菌的发病与其遗传进化有关。本试验粗提OMP具有免疫原性，因为单一的抗原可能不足以产生抵抗强毒攻击的保护力，粗提OMP将有望成为预防坏死杆菌病疫苗的候选成分。

本试验从全菌中粗提取OMP分析分子质量，为进一步了解其结构组成和分析OMP免疫功能提供条件。OMP经Western blot证实具有免疫活性，将为开发OMP亚单位疫苗提供理论基础，也为坏死杆菌病的诊断提供特异性抗原。

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Extraction of Outer Membrane Proteins fromFusobacteriumnecrophorumand Analysis of Its Immunogenicity

XU Jing1, CHEN Li-zhi2, LIU Xiao-ying2, FENG Er-kai2

(1.DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,QiqiharMedicalUniversity,Qiqihar，Heinongjiang,161006,China;2.StateKeyLaboratoryforMolecularBiologyofSpecialEconomicalAnimals,InstituteofSpecialAnimalandPlantScience,ChineseAcademyofAgricultureSciences,Changchun,Jilin,130112,China)

Abstract:In this study, we obtained outer membrane protein (OMP) fromFusobacteriumnecrophorum(FN) and analyzed its immunogenicity.Fusobacteriumnecrophorum(FN) was cultured with sterile brain heart infusion (BHI). The outer membrane protein (OMP) was extracted with 20 mmol/L HEPEs-LiCl buffer. The results showed that we successfully obtained the crude extract of OMP by analysis of SDS-PAGE. Western blot confirmed the immune activity of the OMP. The pathologic examination of mice showed that the OMP was toxic. This study provided basic data for development of FN subunit vaccine.

Key words:Fusobacteriumnecrophorum; outer membrane protein; extraction; immune activity

收稿日期：2015-11-30

基金项目：吉林省科技发展计划项目(20110223)

作者简介：徐晶(1986-)，女，黑龙江省肇东人，硕士研究生，主要从事分子细菌学研究。 *通讯作者

中图分类号:S852.616.3

文献标识码:A

文章编号:1007-5038(2016)06-0026-04