64Cu标记两种奥曲肽类似物的比较

韩振义，梁积新，胡　骥，罗洪义，卿　晶，陈玉清，李　光，李洪玉,

(1.中国原子能科学研究院 同位素研究所，北京　102413；2.原子高科股份有限公司，北京　102413)



64Cu标记两种奥曲肽类似物的比较

韩振义1，梁积新1，胡骥2，罗洪义1，卿晶2，陈玉清2，李光2，李洪玉1, 2

(1.中国原子能科学研究院 同位素研究所，北京102413；2.原子高科股份有限公司，北京102413)

摘要：对奥曲肽类似物DOTA-TOC和DOTA-TATE进行64Cu标记，研究多肽用量与64Cu活度比值、pH、反应温度、反应时间对标记率的影响，优化标记条件；考察标记物在10%胎牛血清与生理盐水中的体外稳定性；评价标记物在正常小鼠体内分布情况以及在U87MG人脑神经胶质瘤中的摄取情况。结果表明：64Cu-DOTA-TOC和64Cu-DOTA-TATE标记率均>95%；在生理盐水中具有良好稳定性，10%胎牛血清中发生缓慢分解；正常小鼠体内分布实验结果显示，两种标记物在血液中清除较快，主要通过肾、肝代谢，64Cu-DOTA-TATE摄取均高于64Cu-DOTA-TOC；64Cu-DOTA-TOC与64Cu-DOTA-TATE给药后肿瘤PET显像清晰，但64Cu-DOTA-TATE显像效果优于64Cu-DOTA-TOC。研究结果可为其医学应用提供依据。

关键词：奥曲肽类似物；64Cu 标记；生物分布；Micro PET显像

神经内分泌肿瘤(neuroendocrine tumors, NETs)可发生于整个神经内分泌系统，最常见于胃、肠和胰腺等部位。美国研究显示，神经内分泌瘤发病率为0.125‰，近年来，检出率呈不断增长趋势。生长抑素(somatostatin, SMS)及类似物对生长抑素受体(somatostatin receptor, SSTR)亲和力强，能在体内特异性结合。SSTR有SSTR1～SSTR5五种亚型，SSTR2在类癌瘤、脑垂体腺瘤、嗜铬细胞瘤、甲状腺髓样癌、脑膜瘤等神经内分泌肿瘤中过度表达[1]。目前，临床上广泛应用的SMS及其类似物主要有奥曲肽(Octreotide, OC)、兰瑞肽(Lanreotide)和维瑞肽(Vapreotide, RC-160)[2]。对SMS进行放射性同位素标记得到放射性多肽药物，能与肿瘤上的 SSTR 特异结合，达到临床功能显像和受体导向治疗的目的[3]。奥曲肽类似物Tyr3-Octreotide (TOC)与Tyr3-Octreotate(TATE)对SSTR2亲和力高，但TATE亲和性为TOC的10倍[4-5]。多种医用放射性核素，如68Ga、90Y、111In、177Lu等通过双功能螯合剂DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸)标记TOC 与TATE，已广泛用于神经内分泌肿瘤的诊断和治疗[6-7]。

近年来，随着全球范围内正电子发射断层扫描技术(PET)的迅速发展，64Cu放射性药物的研究受到越来越多的关注，其主要用于血池与心肌、乏氧、炎症、肿瘤的显像及治疗[8]。64Cu为新型医用正电子核素，半衰期为12.7 h，通过电子俘获(41%)、β-(0.573 MeV，40%)和β+(0.656 MeV，19%)方式衰变。由于64Cu半衰期较长，可用于标记靶向性好但体内代谢时间较长的多肽药物，64Cu标记多肽药物是目前重要研究方向。Hanaoka等[9]研究64Cu-DOTA-TOC在人源神经胶质瘤U87MG模型动物中的生物行为，发现64Cu-DOTA-TOC在肿瘤中浓集高且滞留时间长，肿瘤Micro PET显像清晰；Malmberg 等[10]将64Cu-DOTA-TATE用于动脉粥样硬化斑块的临床研究。国内已经成功采用C-30质子回旋加速器制备高比活度医用64Cu，实现了64Cu的商品化供应[11]。64Cu-DOTA-TOC与64Cu-DOTA-TATE均是具有临床应用前景的奥曲肽类药物，尚未有研究比较这两种药物在神经内分泌瘤方面的应用。本研究对DOTA-TOC 和DOTA-TATE进行64Cu标记，比较这两种多肽类药物在正常小鼠体内的行为以及在U87MG人脑神经胶质瘤中的摄取情况，探讨其作为神经内分泌瘤PET显像剂的应用价值，为临床医学应用及产品提供依据。

1实验材料

1.1主要仪器

Sartorius BS100S电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；CRC-15R放射性活度计：Capintec公司；高效液相(HPLC)色谱系统：Prostar320，美国Varian公司；C18色谱柱：Hypersil ODSΦ 4.6 mm×250 mm，大连依利特公司；C18 Sep-Pak柱：Waters公司；GABI型高效液相色谱放射性监控仪： Raytest公司；1470自动伽玛计数器：Perkin Elmer公司；小型正电子发射断层扫描仪(Micro PET)：Eplus-166，中国科学院高能物理研究所研制；超纯水系统：Milli-Q Advantage A10，Merck公司。

1.2主要试剂

DOTA-TOC：纯度>95%，杭州中肽生化有限公司；DOTA-TATE：纯度>99%，Biomedizinische Forschungsreagenzien GmbH公司；64CuCl2溶液：64Cu放射性核纯度>99%，生产批号分别为20110615、20120613、20130508与20140623，原子高科股份有限公司提供；龙胆酸、乙酸钠、无水乙醇等：分析纯，国药集团化学试剂北京有限公司；乙腈：色谱纯，Burdick&Jackson公司；实验用水均为Milli-Q水。

1.3实验动物

昆明小白鼠：32只，雌性，体重20～25 g，清洁级，中国医学科学院实验动物研究所提供。荷U87MG人脑神经胶质瘤裸鼠：4只，雌性，SPF级，肿瘤直径约10～15 mm，中国医学科学院肿瘤研究所提供。

2实验方法

2.164Cu标记物的制备

100 μL龙胆酸-醋酸钠缓冲液(pH=5.5)中依次加入20～30 μL 1 g/L的DOTA-TOC (或 DOTA-TATE)溶液，5～10 μL64CuCl2溶液(约74～370 MBq，溶于0.1 mol/L HCl中)，充分混合，在50 ℃下反应10～30 min。为优化标记条件，选用多肽(μg)与64Cu放射性活度(mCi)比值分别为2.5、5.0、 7.5、12.5，考察多肽用量与64Cu放射性活度比值对标记率的影响。将5 μL64Cu(约1 mCi)加入到30 μL DOTA-TOC(或DOTA-TATE)中，再分别加入100 μL龙胆酸醋酸钠缓冲液(pH分别为3.6、4.0、4.6、5.0、5.5)，分别混合均匀后在50 ℃下反应30 min后，进行HPLC分析，考察pH对标记率的影响。分别考察反应温度、反应时间对64Cu-DOTA-TOC与64Cu-DOTA-TATE标记率的影响，优化标记条件。

2.264Cu标记物的纯化

将反应液加载到经乙醇和0.1% HCl预先活化后的C18 Sep-Pak柱上，用10 mL 0.1% HCl溶液将游离64Cu洗出，再用3～5 mL 95%乙醇将64Cu-DOTA-TOC(或64Cu-DOTA-TATE)解吸并收集。收集组分用温和N2气流缓慢吹干，用适量体积的生理盐水溶解，备用。

2.3质量控制

采用高效液相色谱(HPLC)法对两种64Cu标记物进行质控分析。C18反相色谱柱，流动相A：0.1% TFA/H2O；流动相B：0.1% TFA/乙腈。洗脱梯度：0～2 min，5%B；2～10 min，5%～80%B；10～15 min，80%B；15～20 min，80%～5%B。流速：1.0 mL/min。紫外检测器波长为220 nm。

2.4体外稳定性

取2.2节所得0.1 mL64Cu-DOTA-TOC(或64Cu-DOTA-TATE)溶液(约111 MBq)加入至0.9 mL 10%胎牛血清中，混匀， 37 ℃下温育，分别于0、0.5、1、2、3 h后取0.1 mL混合液加入离心管中，再加0.1 mL乙醇溶液涡旋混匀，离心，取上清液，测定放化纯度，并与室温时标记物在生理盐水中的稳定性进行比较。

2.5正常小鼠体内生物分布

雌性昆明小白鼠32只，随机分组，每组4只。经尾静脉注射纯化后的0.1 mL64Cu-DOTA-TOC(或64Cu-DOTA-TATE)溶液(370～555 kBq)，注射0.5、1、2、3 h后断头处死，取血、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、肌肉、胰腺等脏器，称重并测量其放射性计数，计算每克脏器的放射性摄取占总注射剂量的百分数(%ID·g-1)。

2.6Micro PET显像

荷U87MG人脑神经胶质瘤裸鼠4只，随机分成2组，每组2只。经尾静脉注射纯化后的0.1 mL64Cu-DOTA-TOC(或64Cu-DOTA-TATE)溶液(约18.5 MBq)，采用混合气体麻醉法对裸鼠麻醉。于给药后1、6 h进行Micro PET显像，每只采集时间为15 min。

3结果与讨论

3.164Cu标记物制备与质量控制

3.1.1制备条件的优化多肽用量与64Cu放射性活度比值、pH、反应温度、反应时间对标记率的影响分别示于图1～图4。

图1　多肽用量与64Cu活度比值对标记率的影响Fig.1　Influence of ratio(peptides mass/64Cu activity)

图2　pH值对标记率的影响Fig.2　Influence of pHon radiolabeling yeild

图3　反应温度对标记率的影响Fig.3　Influence of temperatureon radiolabeling yield

由图1～图4可知，优化后多肽64Cu标记条件：DOTA-TOC(或DOTA-TATE)用量与64Cu放射性活度比值大于12.5，pH为3.6～5.5之间，反应温度在30～50 ℃之间，反应时间大于10 min。

按优化条件对DOTA-TOC与DOTA-TATE进行64Cu标记，得到目标产物64Cu-DOTA-TOC与64Cu-DOTA-TATE，标记率均>95%。经Sep-Pak柱纯化后，两种64Cu标记多肽药物的放化纯度均>98%。

3.1.2质量控制经C18 Sep-Pak柱纯化后的64Cu-DOTA-TOC、64Cu-DOTA-TATE Radio-HPLC图谱示于图5。由图5可知，64Cu-DOTA-TOC的保留时间为12.6 min，游离64CuCl2的保留时间为4.5 min，其放化纯度>95%。64Cu-DOTA-TATE的保留时间为14.5 min，其放化纯度>95%。

图4　反应时间对标记率的影响Fig.4　Influence of time on radiolabeling yield

图5　64Cu-DOTA-TOC和64Cu-DOTA-TATE的Radio-HPLC图谱Fig.5　Radio-HPLC spectrum of64Cu-DOTA-TOC and64Cu-DOTA-TATE

3.2体外稳定性

64Cu-DOTA-TOC与64Cu-DOTA-TATE在10%胎牛血清与生理盐水中的体外稳定性分别示于图6、图7。从图中可以看出，64Cu-DOTA-TOC与64Cu-DOTA-TATE在10%胎牛血清中发生缓慢分解，但37 ℃下温育2 h后放化纯度仍大于90%。室温下在生理盐水中温育3 h后，放化纯度大于95%，未见明显分解，表明其在生理盐水中稳定性好。

3.3正常小鼠体内的生物学分布

64Cu-DOTA-TOC与64Cu-DOTA-TATE在正常小鼠体内的生物分布数据列于表1。

由表1可知，64Cu-DOTA-TOC在血液中放射性摄取少且清除快；肾脏放射性摄取高，给药30 min后达到(10.55±1.71) %ID·g-1，滞留时间长，3 h 后仍为(4.31±0.90) %ID·g-1，提示标记物在小鼠体内主要通过肾代谢；在肝脏摄取高且滞留时间长，给药30 min与3 h后分别为(6.29±0.64) %ID·g-1与(4.99±0.78) %ID·g-1；胰腺中放射性摄取高且滞留时间长，提示胰腺中生长抑素受体的存在。64Cu-DOTA-TOC在生物体内稳定性较差，可能部分发生分解产生游离64Cu，从而表现为肝、胃、小肠摄取高。

图6　64Cu-DOTA-TOC在10%胎牛血清与生理盐水中的稳定性Fig.6　In vitro stability of64Cu-DOTA-TOCin 10% bovine serum and 0.9% saline

图7　64Cu-DOTA-TATE在10%胎牛血清与生理盐水中的稳定性Fig.7　In vitro stability of64Cu-DOTA-TATEin 10% bovine serum and 0.9% saline

64Cu-DOTA-TATE在血液中浓集少，但摄取高于64Cu-DOTA-TOC(给药后1、2、3 h，P<0.05，二者均有显著性差异)；在肝中摄取高于64Cu-DOTA-TOC；肾中摄取高且代谢缓慢，在30 min时摄取低于64Cu-DOTA-TOC，随后，摄取均高于64Cu-DOTA-TOC，可知，64Cu-DOTA-TOC在肾中代谢速度快于64Cu-DOTA-TATE；胰腺中摄取低于64Cu-DOTA-TOC。

3.4Micro PET显像

荷U87MG人脑神经胶质瘤裸鼠在给药1、6 h后的Micro PET显像示于图8。

Table 1Invivobiodistribution of64Cu-DOTA-TOC and

组织不同时间各组织放射性摄取率/(%ID·g-1)30min1h2h3hTOCTATETOCTATETOCTATETOCTATE血1.96±0.522.09±0.310.73±0.181.38±0.161)0.61±0.081.24±0.291)0.49±0.051.13±0.281)心1.59±0.382.13±0.351)0.90±0.202.04±0.121.39±0.202.51±0.391)1.05±0.132.34±0.311)肝6.29±0.648.34±1.091)4.15±0.847.65±0.941)5.11±0.516.41±0.354.99±0.786.02±0.071)脾0.92±0.211.54±0.100.64±0.191.88±0.251.25±0.152.95±0.971)1.23±0.163.05±0.711)肺3.99±0.923.75±0.173.19±0.583.54±0.441)3.78±0.914.56±0.583.21±0.544.08±0.221)肾10.55±1.719.72±1.025.91±0.868.57±0.525.83±0.787.03±0.484.31±0.906.44±0.901)胃4.43±0.434.31±0.293.86±0.935.71±0.794.22±0.726.76±0.831)4.44±0.565.08±0.781)小肠3.25±0.633.50±0.511)2.35±1.256.18±1.921)3.28±0.554.82±0.561)2.73±0.503.60±0.231)肌肉0.63±0.210.76±0.080.30±0.120.74±0.430.29±0.060.61±0.050.22±0.050.67±0.09胰腺4.14±0.722.35±0.191)3.30±0.402.46±0.091)3.65±0.512.48±0.151)2.63±0.792.37±0.461)

注：1)64Cu-DOTA-TATE与64Cu-DOTA-TOC相比，放射性摄取有显著性差异，P<0.05

a——TOC给药后1 h；b——TOC给药后6 h；c——TATE给药后1 h；d——TATE给药后6 h图8　64Cu-DOTA-TOC与64Cu-DOTA-TATE在荷U87MG人脑神经胶质瘤裸鼠的Micro PET显像a——at 1 h postinjection of TOC;b——at 6 h postinjection of TOC;c——at 1 h postinjection of TATE;d——at 6 h postinjection of TATEFig.8　Micro PET images of64Cu-DOTA-TOC and64Cu-DOTA-TATEin U87MG tumor-bearing nude mice

从图8可知，64Cu-DOTA-TOC与64Cu-DOTA-TATE给药1 h后肿瘤均显像清晰；给药6 h后，64Cu-DOTA-TATE肿瘤显像效果优于64Cu-DOTA-TOC，可能原因为U87MG人脑神经胶质瘤中SSTR2高表达，DOTA-TATE对SSTR2的亲和力高于DOTA-TOC。

64Cu-DOTA-TATE在U87MG人脑神经胶质瘤中放射性浓集更高，PET显像效果更佳，作为此类肿瘤的阳性PET显像剂具有一定优势。

4小结

64Cu-DOTA-TOC与64Cu-DOTA-TATE在生理盐水中具有良好的稳定性， 10%胎牛血清中长时间温育后，发生缓慢分解。在正常小鼠体内均表现为血清除快；肝、肾放射性摄取高，体内代谢途径主要为肾与肝，但64Cu-DOTA-TATE分布高于64Cu-DOTA-TOC；胰腺中有明显放射性摄取，提示胰腺中生长抑素受体的存在。肿瘤PET显像均清晰可见，但64Cu-DOTA-TATE效果优于64Cu-DOTA-TOC。实验结果表明，64Cu-DOTA-TOC和64Cu-DOTA-TATE可用于生长抑素受体阳性肿瘤PET显像，研究结果为医学应用及产品市场化提供依据。

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Comparison of Two Kinds of64Cu Labelled Octreotide Analogues

HAN Zhen-yi1, LIANG Ji-xin1, HU Ji2, LUO Hong-yi1, QING Jing2,CHEN Yu-qing2, LI Guang2, LI Hong-yu1,2

(1.DepartmentofIsotope,ChinaInstituteofAtomicEnergy,Beijing102413,China;2.HTACo.,LTD,Beijing102413,China)

Abstract:Octreotide analogues DOTA-TOC and DOTA-TATE were labeled with64Cu. The influences of the ratio of peptide mass to64Cu activity, pH value, temperature and reaction time on labeling yield were investigated. The optimum labeling was determined.Invitrostability tests in saline and 10% bovine serum had been carried out. Biodistribution of the two radiolabelled compounds in normal mice and Micro PET imaging in nude mice bearing U87MG tumor had been evaluated. The results showed that the labeling yields of64Cu-DOTA-TOC and64Cu-DOTA-TATE were higher than 95%. Two kinds of octreotide analogues labeled with64Cu were quite stable in saline and decomposed slowly in 10% bovine serum at 37 ℃. Biodistribution results in normal mice showed that two64Cu labelled tracers had similar profiles. Both of the compounds washed out from the blood quickly. High uptake of radioactivity in liver and kidneys indicated the tracers were excretedviaboth hepatobiliary system and renal system. At the same time, compared to64Cu-DOTA-TOC, higher radioactivity accumulation of64Cu-DOTA-TATE in liver and kidneys was observed. Micro PET images of U87MG tumor-bearing nude mice with64Cu-DOTA-TOC and64Cu-DOTA-TATE showed the tumors very clearly. The radioactivity uptake of64Cu-DOTA-TATE in tumor was higher than that of64Cu-DOTA-TOC. This work has paved the way for further preclinical and clinical application of64Cu-DOTA-TOC and64Cu-DOTA-TATE as PET tumor imaging agents.

Key words：octreotide analogues;64Cu-labeling; biodistribution; Micro PET imaging

收稿日期：2016-01-14;修回日期：2016-03-14

基金项目：国际原子能机构 CRP资助项目(Contract No.15899)

作者简介：韩振义(1985—)，男，山东人，执业药师，分析化学专业 通信作者：梁积新，研究员，E-mail: liangjixin99@yahoo.com

中图分类号：TL92+3

文献标志码：A

文章编号：1000-7512(2016)02-0082-07

doi：10.7538/tws.2016.29.02.0082