半边莲煎剂对肝癌的抑制作用及对P27和BCL-2表达的影响

刘晓宇，张　红

(大连医科大学附属第二医院 中医科，辽宁 大连 116027)



半边莲煎剂对肝癌的抑制作用及对P27和BCL-2表达的影响

刘晓宇，张红

(大连医科大学附属第二医院 中医科，辽宁 大连 116027)

[摘要]目的研究半边莲煎剂对肝癌h12荷瘤小鼠的抗肿瘤作用。方法建立肝癌h12荷瘤小鼠实体瘤模型，将24只小鼠分为3组，生理盐水组、半边莲煎剂组和5-氟脲嘧啶组，每组各8只。通过测定荷瘤小鼠的瘤重、抑瘤率观察半边莲煎剂对肿瘤生长的抑制作用，并采用免疫组化技术检测肿瘤组织中P27和BCL-2的表达情况。结果半边莲煎剂组瘤重与生理盐水组相比明显减小，差异有显著性意义(P<0.05)。半边莲有明显的抑瘤作用，其抑瘤率为39.48%。P27和BCL-2在3组中均呈阳性表达，半边莲煎剂组的P27表达增强，BCL-2表达减弱，与生理盐水组比较，差异均有显著性意义(P<0.05)；而半边莲煎剂组与5-氟脲嘧啶组比较，差异无显著性意义(P>0.05)。结论半边莲煎剂具有明显的抑瘤作用，其作用机制可能与上调P27和下调BCL-2表达有关。

[关键词]半边莲；P27；BCL-2；原发性肝癌

[引用本文]刘晓宇，张红. 半边莲煎剂对肝癌的抑制作用及对P27和BCL-2表达的影响[J].大连医科大学学报，2016,38(1)：20-23.

半边莲又名急解索、蛇舌草等，为桔梗科植物半边莲的全草，多在夏季采收，连根拔起后入药。其始载于《滇南本草》，后李时珍在《本草纲目》中亦有记载，“半边莲，小草也。生阴湿塍堑边。就地细梗引蔓，节节而生细叶。秋开小花，淡红紫色，止有半边，如莲花状，故名”。其性辛、平，味甘，归心、小肠、肺经，具有清热解毒、利尿、消肿的功效。它是临床上常见的抗肿瘤中药，可用于治疗肝癌、胃癌、肠癌、乳腺癌等多种肿瘤，并可辅以外敷治疗癌症[1]。本实验建立小鼠移植性肝癌h12荷瘤模型，检测了半边莲煎剂对肿瘤大小及P27和BCL-2表达的影响，从而进一步探讨半边莲的抗肿瘤作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验药物与试剂：半边莲煎剂(半边莲煎煮浓缩而成，浓度为1 g/mL，由大连医科大学附属第二医院中草药局提供)；5-氟脲嘧啶(生产批号0802162，由天津金耀氨基酸有限公司生产，每支250 mg/10 mL)。兔抗鼠P27单克隆抗体、兔抗鼠BCL-2单克隆抗体、SP免疫组织化学检测试剂盒及浓缩型DAB试剂盒(购于北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.1.2实验动物及癌株：昆明小鼠24只，雌雄各半，6～8周龄，体重18～24 g，购于大连医科大学实验动物中心。瘤株为小鼠肝癌腹水瘤细胞系h12，购自大连医科大学病理教研室。

1.1.3实验设备：Olympus-206024 型显微镜(日本Olympus 公司)、滑台切片机(日本樱花牌)、干燥箱(上海事实验仪器总厂 101-1型)、电热恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂 202-2-S型)、电热恒温水温箱(北京市医疗设备厂 HWI型)等。

1.2方法

1.2.1建立动物模型及分组：在无菌条件下，取已生长7～9 d传代接种的h12细胞株，将细胞5×106个/mL，0.1 mL/只，接种于小鼠右腋下皮下造成实体瘤模型，随机分为生理盐水组、半边莲煎剂组和5-氟脲嘧啶组。从造瘤次日起，生理盐水组以生理盐水0.4 mL/只灌胃；半边莲煎剂组以半边莲0.4 mL/只(约含生药0.4 g)灌胃；5-氟脲嘧啶组以5-氟脲嘧啶按20 mg/kg·d腹腔注射；3组均1次/d，共连续给药14 d。

1.2.2瘤重、抑瘤率的测定：给药14 d后停药，次日断颈处死小鼠，剥离瘤组织称重备用，计算抑瘤率。抑瘤率(%)=(对照组平均瘤重-用药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。

1.2.3采用免疫组化方法检测肿瘤组织P27、BCL-2蛋白的表达：选择合适的蜡块，进行切片，厚约4～5 μm，烤片60 min，二甲苯脱蜡水化，酒精梯度水化，流水冲洗10 min，0.01 mol/L PBS冲洗3 min×3次， 3%H2O2消化内源性过氧化物酶10 min，PBS洗3 min ×3次，擦干，0.01 mol/L CB缓冲液pH 6.0微波修复100 ℃，室温放置10 min冷却，以PBS冲洗3 min ×3次，滴加山羊血清封闭液，室温放置10 min后，倾去多余液体，勿洗，滴加P27、BCL-2的一抗工作液，4 ℃过夜。次日取出切片，室温放置20 min， PBS冲洗5 min×3次，滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃ 20 min。0.01 mol/L PBS冲洗 3 min×3次，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP)37 ℃ 20 min，0.01 mol/L PBS冲洗 5 min×4次，进行DAB显色，流水冲洗10 min，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。

1.2.4结果判断：于400倍光镜视野下，选取每张切片中P27、BCL-2着色部分，采集图像，并利用Image-proplus (美国Media Cybernetics公司)图像分析软件以检测染色阳性物质的面积和积分光密度，求积分光密度平均值，用平均光密度值(IOD)代表组织中特定蛋白表达水平的高、低，即代表P27、BCL-2的含量。

1.3统计学方法

2结果

2.1瘤重、抑瘤率的测定

半边莲煎剂组与生理盐水组瘤重相比明显减小，差异有显著性意义(P<0.05)，半边莲有明显的抑瘤作用，其抑瘤率为39.48%。见表1。

表1　半边莲的抑瘤作用

1)与生理盐水组相比，P<0.05；2)与生理盐水组相比，P<0.01

2.2P27、BCL-2表达

P27、BCL-2在各组中均呈阳性表达，为均匀或粗细不等的棕黄色颗粒，P27主要在细胞核内表达，BCL-2主要在细胞浆内表达。与生理盐水组相比，半边莲煎剂组P27表达增强，BCL-2表达减弱，差异有显著性意义(P<0.05)。而半边莲煎剂组与5-氟脲嘧啶组相比，P27、BCL-2表达差异无显著性意义(P>0.05)。见表2、图1和2。

3讨论

原发性肝癌是中国目前较为常见的恶性肿瘤之一，据统计其死亡率在消化系统恶性肿瘤中列第3位。从分子生物学角度，肿瘤既是细胞增殖失控同时也是细胞凋亡异常的疾病，其发生涉及原癌基因的激活和抑癌基因失活等多基因的改变。而近年来，通过对细胞周期调控理论的深入研究，认识到细胞周期调控紊乱与肿瘤的发生有着重要的联系。因此，肿瘤细胞的增殖和凋亡与细胞周期的凋亡密切相关，而对于肿瘤细胞，周期阻滞作用是评价抗肿瘤治疗效果的一个重要指标[2]。

表2P27、BCL-2 表达的比较

Tab 2 The expressions of P27 and BCL-2

组别nP27表达量BCL-2表达量生理盐水组8206678.25±35573.23282994.94±50198.90半边莲煎剂组8367489.93±87895.971)176866.60±42822.231)5-氟脲嘧啶组8355193.40±88105.661)175797.89±37116.581)

1)与生理盐水组相比，P<0.05

图1　P27的表达(×400 )

图2　BCL-2的表达(×400 )

P27是由Polyak等[3-4]在研究细胞间接触抑制和转化生长因子诱导细胞生长停滞于G1期机制时从静息细胞中发现的一种热稳定蛋白，该基因位于人染色体12p13处，由至少2个长度为474 bp和120 bp的外显子和1个约600 bp的内含子组成，两者共同组成1个594 bp的开放阅读框架，编码1条198个氨基酸的多肽，其分子量为27 kD，故称为P27。P27为细胞周期重要的负性调控因子，可直接影响限制点的调控，进而调控细胞的增殖活性[5]。其中主要抑制作用于G1期，主要是通过抑制cyclin-CDK复合物功能来实现的，使细胞阻断于G1期，不能进入S期，达到对细胞周期的负调控，从而抑制细胞增殖。相关研究显示P27的表达量和原发性肝癌的恶性程度及复发、转移、预后均密切相关[6-8]。

BCL-2是Tsujimoto等[9]从滤泡状B细胞淋巴瘤中发现的，该基因位在人18q21.3染色体上，全长约含230 kb，由3个外显子和2个内含子组成，它既是编码26 kD的线粒体膜整合蛋白，同时也是含有229个氨基酸的跨膜蛋白。BCL-2是一种具有调控细胞凋亡作用的基因，在生长因子受体介导的信号传导中起作用，通过抑制细胞凋亡，延长生存时间。钱燕春等[10]研究认为BCL-2与肝癌的临床分期、淋巴结转移及预后呈正相关。相关研究显示BCL-2的表达与肝癌的发生、复发、转移及分级、预后等有着重要的联系[11]。

近年来，对于具有抗肿瘤作用同时副作用相对较小的中药研究成为热点，中药在预防肝癌的发生、抑制生长、防止复发、转移等多方面都有发展及应用。现代研究表明，半边莲的化学成分为多种生物碱，黄酮甙、菊糖、延胡索酸、对羟基苯甲酸钠等以及皂甙和氨基酸等[12]。其中生物碱成分主要为山梗菜碱、山梗菜酮碱、山梗菜醇碱和去甲山梗菜酮碱，具有清热解毒、利尿消肿、清热利湿退黄的功效，可用于治疗各种肿瘤，水肿，阳性毒肿，蛇虫咬伤、动脉粥样硬化等疾病。目前对Hela细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞等生理学效应的研究表明，半边莲对肿瘤细胞有抑制作用 。高永琳等[13]报道，半边莲对Hela细胞增殖的直接抑制作用不明显，但可通过促进细胞内储藏钙的释放和细胞外钙离子的内流，显著提高细胞内游离钙的浓度，从而诱导肝癌细胞的凋亡。高冬等[14]研究发现半边莲可通过影响细胞内游离钙离子浓度进而诱导人肝癌细胞发生凋亡。李建芬[15]对半边莲煎剂的研究认为其对小鼠腹水癌细胞氧的摄取有抑制作用。本实验从细胞增殖和细胞凋亡的基因层面研究半边莲的抑肝癌作用。实验表明，半边莲一方面可使具有抑制细胞增殖作用的P27表达增强，另一方面可使具有阻断细胞凋亡作用的BCL-2表达减弱，而有关细胞增殖和细胞凋亡两方面的其他多种基因的表达情况，还有待进一步研究和探讨。

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Influence of Banbianlian on expression of P27 and BCL-2 in h12 hepatocelluar carcinoma-bear mice and anti-tumor effect

LIU Xiao-yu, ZHANG Hong

(TraditionalChineseMedicine,theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116027,China)

[Abstract]Objective To study the anti-tumor effects of Banbianlian on h12 hepatocelluar carcinoma-bear mice. Methods h12 hepatocelluar carcinoma-bear mice model was established; 24 mice were divided equally into three groups: normal saline treated group, Banbianlian treated group and 5-Fu treated group. The tumor was removed and measured. P27 and BCL-2 expression in the tumor tissues were examined in immunohistochemistry. Results Banbianlian inhibited the tumor growth of hepatocelluar carcinoma-bear mice with the inhibitory rate 39.48%. The expression of P27 and BCL-2 in three groups were positive. P27 expression was stronger, while BCL-2 expression was weaker in Banbianlian treated group than those in normal saline treated group (P<0.05). Two protein expression were not significantly different between Banbianlian treated group and 5-Fu treated group (P>0.05). Conclusion Banbianlian could inhibit tumor growth, which could be related to the abnormal expression of P27 and BCL-2.

[Key words]Banbianlian; P27; BCL-2; hepatocelluar carcinoma

doi:论著10.11724/jdmu.2016.01.05

作者简介：刘晓宇(1984-)，女，辽宁大连人，主治医师。E-mail：liuxiaoyu528@163.com 通信作者：张 红，教授。E-mail：zh19600901@163.com

[中图分类号]R273

[文献标志码]A

文章编号：1671-7295(2016)01-0020-04

(收稿日期：2015-07-06；修回日期:2015-11-03)