蓝莓花青素提取物对H2O2诱导人胃癌BGC-823细胞氧化损伤的保护作用

张　震，周婷婷，张　华，李亚晨

(1.鞍山市肿瘤医院 科教科，辽宁 鞍山 114034；2.大连理工大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116024；3.大连医科大学 劳动卫生与环境卫生教研室，辽宁 大连 116044)



蓝莓花青素提取物对H2O2诱导人胃癌BGC-823细胞氧化损伤的保护作用

张震1，周婷婷2，张华2，李亚晨3

(1.鞍山市肿瘤医院 科教科，辽宁 鞍山 114034；2.大连理工大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116024；3.大连医科大学 劳动卫生与环境卫生教研室，辽宁 大连 116044)

[摘要]目的在细胞水平上分析蓝莓花青素提取物的抗氧化活性。方法用6.25 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL蓝莓花青素提取物预处理人胃癌BGC-823细胞24 h后，再加入1 mmol/L H2O2诱导损伤2 h。按不同处理分为对照组、H2O2处理组和蓝莓花青素保护组。采用MTT比色法检测细胞活力、相差显微镜观察细胞形态、荧光探针DCFH-DA测定细胞活性氧(ROS)生成量、比色法和可见光法测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)的活性，分析不同浓度的蓝莓花青素提取物预处理对H2O2诱导BGC-823细胞氧化损伤的影响。结果与H2O2处理组相比较，6.25 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL蓝莓花青素提取物预处理均能增加BGC-823细胞活力(P<0.05)。25 μg/mL和100 μg/mL蓝莓花青素提取物预处理能阻止H2O2诱导的BGC-823细胞形态损伤，抑制ROS生成，增加GSH-Px和CAT的活性。结论蓝莓花青素提取物对H2O2诱导人胃癌BGC-823细胞氧化损伤具有保护作用。

[关键词]蓝莓花青素提取物；BGC-823细胞；氧化损伤；抗氧化

[引用本文]张震，周婷婷，张华，等.蓝莓花青素提取物对H2O2诱导人胃癌BGC-823细胞氧化损伤的保护作用[J].大连医科大学学报，2016,38(1)：16-19.

花青素是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属多酚类化合物，具有抗炎症、抗微生物、抗衰老和抗肿瘤等作用[1-5]，研究表明这些作用与其抗氧化活性有关[6]。

蓝莓在已知植物中花青素含量最高，且种类丰富，因而蓝莓花青素比一般植物花青素具有更好的生理活性。本课题组首先从蓝莓中提取花青素，经高效液相色谱分析(HPLC)花青素含量为30.45%，体外抗氧化活性分析显示蓝莓花青素具有较强的自由基清除能力。为进一步了解蓝莓花青素在细胞氧化应激中的作用，本研究以H2O2诱导人胃癌细胞BGC-823氧化损伤，用不同浓度花青素处理细胞，来观察蓝莓花青素对细胞氧化损伤的保护作用及其可能的机制。

1材料和方法

1.1材料

蓝莓花青素(LM)由大连理工大学生物工程实验室制备，以矢车菊色素为标准品，经高效液相色谱(HPLC)定性与定量分析，花青素含量为30.45%，主要有13种花青素组分；人胃癌细胞BGC-823购自中科院上海细胞所细胞库；胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司；GSH-Px和CAT试剂盒购自南京建成生物技术公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)购自美国Thermo公司；2′,7′-二氯荧光素二乙酸(DCFH-DA)购自碧云天生物技术研究所；二甲基亚砜(DMSO)购自东方科技公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2细胞培养与处理

BGC-823细胞在含有10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素和100 mg/mL链霉素的高糖DMEM培养基中，37 ℃，5%CO2条件下培养。

选取状态良好的对数期细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液并计数，分别接种于96、24孔或6孔板中，24 h后进行分组处理。设对照组、H2O2处理组和蓝莓花青素保护组。蓝莓花青素保护组分别加入6.25 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL蓝莓花青素提取物，对照组加入等体积培养基，处理24 h，PBS清洗1～2遍，再加等体积的1 mmol/L H2O2损伤2 h。每个浓度设6个平行孔。

1.3细胞存活率检测

细胞接种于96孔板中，每孔6000～8000个细胞。细胞经上述方法药物处理后，每孔加入10 μL的MTT(浓度为5 mg/mL)，同时设置不含细胞的空白对照孔，继续培养4 h后，弃上清液，加入二甲亚砜(DMSO)100 μL，振荡20 min，使紫色结晶完全溶解，用酶标仪在570 nm处测定OD值。细胞存活率(%)=(OD实验组-OD空白对照)/(OD对照组-OD空白对照)×100%。

1.4细胞的形态学观察

细胞接种于24孔板，每孔4×104个细胞，分别加入25 μg/mL 和100 μg/mL的蓝莓花青素作用24 h，再加入1 mmol/L H2O2，对照组加入同等体积的培养基，1 h后在倒置相差显微镜下观察细胞形态并拍照(×40)。

1.5活性氧(ROS)含量检测

细胞接种于24孔板，如1.2药物处理后加入10 μmol/L DCFH-DA，37 ℃孵育细胞30 min，PBS 洗涤细胞2次，采用荧光显微镜(×40)检测ROS含量。

1.6GSH-Px和CAT活性检测

细胞接种于6孔板，每孔2×105个细胞，如1.2药物处理后用0.25%胰酶消化细胞，PBS洗涤细胞2次后加入细胞裂解液，于冰上裂解30 min，14000 r/min离心15 min取上清，即为细胞总蛋白，蛋白置于冰中用于酶活性检测。按GSH-Px和CAT检测试剂盒说明书检测GSH-Px和CAT活性。蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定，用牛血清白蛋白作标准曲线。

1.7统计学方法

2结果

2.1蓝莓花青素对BGC-823细胞活力的影响

用6.25 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL的蓝莓花青素孵育培养BGC-823细胞24 h，能显著提高细胞活性，减少H2O2引起的细胞损伤。见图1。

2.2蓝莓花青素对H2O2诱导的BGC-823细胞形态的影响

和对照组相比，H2O2处理使BGC-823细胞明显皱缩、破裂，而蓝莓花青素明显阻止细胞皱缩变形。见图2。

图1　蓝莓花青素对BGC-823细胞活力的影响Fig1 Effect ofanthocyanins from blueberry on BGC-823 cells viability#与对照组比较，P<0.05； *与H2O2组比较，P<0.05

2.3对H2O2诱导的BGC-823细胞ROS生成的影响

H2O2诱导BGC-823细胞生成ROS，显微镜下可见大量荧光信号，25 μg/mL和100 μg/mL 蓝莓花青素预处理均能抑制BGC-823细胞ROS的生成，特别是100 μg/mL的蓝莓花青素组显著抑制BGC-823细胞ROS的生成。见图3。

2.4GSH-Px和CAT活性变化

蓝莓花青素预处理可使细胞内的谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶活性比H2O2组显著增强，且具有剂量依赖性。见表1。

图2　蓝莓花青素对BGC-823细胞形态的影响Fig 2 The morphology of BGC-823 cells (×40)

图3　蓝莓花青素对BGC-823细胞ROS生成的影响Fig 3 Effect of anthocyanins from blueberry on BGC-823 cells ROS generationA: DCF-DA荧光染色图(×40)； B: DCF-DA 荧光强度统计图。#与对照组比较，P<0.05； *与H2O2组比较，P<0.05

(U·mg-1protein)

1) 与1 mmol/L H2O2处理组比较，P<0.05

3讨论

检测物质清除自由基的能力，由于操作简便、花费时间短，目前已成为测定物质抗氧化活性的常用方法。前期本组从蓝莓中提取花青素，测定其对DPPH+自由基、ABTS+阳离子自由基、超氧阴离子和羟自由基的清除能力，以及总抗氧化能力、还原力和对脂质过氧化的抑制能力，表明蓝莓花青素提取物对上述自由基具有较强的清除能力，总抗氧化活性和还原力也较高。Lee等[7]报道了从阔叶山麦冬果实中提取的花青素具有清除DPPH+自由基和ABTS+阳离子自由基的能力。Wang等[8]也报道了笃斯越桔中DPPH+自由基和ABTS+阳离子自由基清除能力与花青素含量正相关。然而，体外化学抗氧化活性分析方法不能真正反映物质在细胞和生物体内的抗氧化作用。Lv等[9]分析了紫鹃茶浸出液花青素组分及其细胞抗氧化活性，结果表明紫鹃茶花青素能抑制HepG2细胞内ROS的生成。Shen等[10]报道了黑麦多酚类提取物可以明显提高小鼠血清和肝脏CAT、SOD和GSH-Px等水平。本研究利用蓝莓花青素提取物作用于BGC-823细胞，在细胞水平上分析了其抗氧化活性。结果显示蓝莓花青素提取物对H2O2诱导的BGC-823细胞损伤均具有保护作用，且具有剂量依赖性，蓝莓花青素提取物还能抑制H2O2诱导的BGC-823细胞ROS生成，增加细胞内的GSH-Px和CAT活性，因此，蓝莓花青素提取物可能通过增加细胞内的GSH-Px和CAT活性，对H2O2诱导的BGC-823细胞损伤起保护作用。

参考文献：

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Protective effect of anthocyanins extract from blueberry on human gastric cancer BGC-823 cell oxidative injury induced by H2O2

ZHANG Zhen1, ZHOU Ting-ting2, ZHANG Hua2, LI Ya-chen3

(1.DepartmentofScienceandEducation,TumorHospitalofAnshan,Anshan114034,China; 2.DepartmentofLifeScienceandBiotechnology,DalianUniversityofTechnology,Dalian116024,China; 3.DepartmentofOccupationalandEnvironmentalHealth,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)

[Abstract]Objective To explore the antioxidant activity of anthocyanins extract from blueberry on cells. Methods The human gastric cancer BGC-823 cells were treated with anthocyanins extract from blueberry for 24 h with 6.25 μg/mL, 12.5 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL and 100 μg/mL, then treated with H2O2(1 mmol/L) for 2 h. The cell viability was measured by MTT assay, the cell morphological change observed by phase contrast microscope, reactive oxygen species (ROS) measured with the fluorescent probe 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA).The activity of glutathione peroxidase (GSH-Px) and catalase (CAT)were analyzed by the chromatometry and the visible spectrophotometry. Results Pretreatment with varied concentrations of anthocyanins extract from blueberry all increased BGC-823 cell viability (P<0.05). Pretreated with 25 μg/mL and 100 μg/mL anthocyanins extract inhibited the formation of ROS and elevated the activities of GSH-Px and CAT. Conclusion The anthocyanins extract from blueberry could protect human gastric cancer BGC-823 cell to oxidative injury induced by H2O2.

[Key words]anthocyanins extract; BGC-823 cell; oxidative injury; antioxidation

doi:论著10.11724/jdmu.2016.01.04

基金项目：辽宁省自然科学基金项目(2013023054)

作者简介：张 震(1974-)，男，辽宁鞍山人，副主任医师。E-mail：luanwufeiyang08@163.com 通信作者：李亚晨，副教授。E-mail: liy76@yahoo.com

[中图分类号]R151.1

[文献标志码]A

文章编号：1671-7295(2016)01-0016-04

(收稿日期：2015-12-09；修回日期：2015-12-28)