高效液相色谱法测定心肌肽中组胺含量的可行性分析

矫　建，张婷婷, 杜　娟，刘进朋，鲁　军

(1. 大连市药品检验所，辽宁 大连 116021；2. 大连市第二人民医院，辽宁 大连 116011 )



高效液相色谱法测定心肌肽中组胺含量的可行性分析

矫建1，张婷婷1, 杜娟2，刘进朋1，鲁军1

(1. 大连市药品检验所，辽宁 大连 116021；2. 大连市第二人民医院，辽宁 大连 116011 )

[摘要]目的建立和验证高效液相色谱(HPLC)测定心肌肽中组胺含量的方法。方法采用多道生理记录仪记录受试样品致猫血压下降情况。用丹磺酰氯柱前衍生化高效液相色谱法测定心肌肽中组胺含量，心肌肽溶液经三氯乙酸沉淀后，取上清液以丹磺酰氯丙酮溶液为衍生化试剂，衍生化后进行高效液相色谱测定。色谱条件为：色谱柱C18柱(250 mm×4.6 mm，i.d.,5 μm)，以水-乙腈为流动相梯度洗脱，检测波长254 nm，并对此方法进行方法学考察(标准曲线的绘制、加标、回收率、精密度重复性、专属性)。分析样品中组胺含量与致猫血压下降值之间的相关性。结果1～5号样品dT/dS值分别为(0.22±0.07,0.74±0.07,0.91±0.03,0.93±0.10,1.16±0.05)均为合格产品。组胺对照品在0.1～10 μg/mL范围内线性关系良好,相关系数(r)>0.996，检出限为0.03 μg/mL，平均加标回收率>91.1%。日内与日间精密度RSD均<1.0%,重复性及专属性均符合生物样品分析要求。SPSS软件分析心肌肽中组胺的含量与降压物质检查法中降压反应比值(dT/dS)成良好的线性相关(r=0.974，P=0.036)。结论采用HPLC法测定心肌肽溶液中组胺的含量，并结合降压反应比值(dT/dS)设定组胺含量的限值可能成为控制心肌肽原料药质量的良好方法。

[关键词]降压物质；心肌肽；组胺；高效液相色谱法；丹磺酰氯柱前衍生法

[引用本文]矫建,张婷婷，杜娟,等.高效液相色谱法测定心肌肽中组胺含量的可行性分析[J].大连医科大学学报，2016,38(3)：228-231.

组胺属于一种生物胺，由组氨酸脱羧酶(HDC)以组氨酸为底物合成，由组氨酸脱羧形成，作为生物活性物质存在于大多数活的生物中。组胺被公认为是一种过敏反应介质，是免疫性刺激或非免疫性刺激生物反应的介质[1]，同时，单胺氧化酶抑制剂可以增加含组胺类物质的毒性[2]。鱼类等食品的中毒多由组胺所致，当 100 g 食品中组胺的含量超过50 mg就会产生致命危害。组胺有一定的血管扩张作用，超过一定剂量会使血压迅速下降[3]，导致心率增加，冠脉及脑血管供血不足、甚至休克等[4]。

心肌肽是从不包括人的哺乳动物心脏中提取的多肽，可直接作用于心肌细胞，促进在多种损伤因素下心肌的修复[5-6]。动物脏器提取物或发酵产物都有可能含有组胺，中国药典规定此类制剂须进行降压物质检查。目前检测组胺的方法为采用多道生理记录仪检测受试样品致实验动物血压下降情况。本文参考水产品、肉制品等食品中的组胺检测方法[3，7-9]，建立了心肌肽中组胺的高效液相色谱检测方法，拟为心肌肽的质量控制提供一种新的替代方法。

1材料和方法

1.1实验仪器

MP100 多道生理仪(美国BIOPAC公司)，高效液相色谱仪(Thermo Scientific，Ultimate 3000，配有四元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器)，XS105-DU十万分之一分析天平(Mettler公司)，离心机(Beckman Allegra X-30R Centrifuge)，ZSXH-625 型恒温水浴箱(上海智城分析仪器制造有限公司)，涡旋振荡器(德国IKA公司)。

1.2实验试剂

磷酸组织胺(批号：150510-200412)，丹磺酰氯(CAS 号：805- 65- 2，批号：101065422)，乙腈，丙酮为色谱纯；柠檬酸钠，盐酸，三氯乙酸，碳酸钠，氨水，无水乙醚均为分析纯。5 批心肌肽溶液，由大连珍奥药业有限公司提供。

1.3实验动物

猫，3只，体重2.0 ～ 4.0 kg，均为雄性, 购于大连医科大学，合格证号为：211003700000448。

1.4方法

1.4.1降压物质检查

按照《中国药典》2015年版四部通则1145[10]降压物质检查法和厂家标准，将猫用苯巴比妥(1000 mg/kg)和戊巴比妥钠(20 mg/kg)腹腔注射麻醉后，固定于保温手术台上，分离气管，必要时插入插管以使呼吸畅通。在一侧颈动脉插入连接到多道生理记录仪的动脉插管，管内充满适宜的抗凝剂溶液，以记录血压。在一侧股静脉内插入静脉插管，供注射对照品及样品用。

5 批心肌肽溶液对猫的降压反应：取对照品稀释液的剂量为dS，心肌肽溶液的剂量为dT，照下列次序注射一组4 个剂量：dS、dT、dT、dS。然后以第1与第3、第2与第4剂量所致的反应分别比较；如 dT所致的反应值均不大于dS所致反应值的1/2，即dT与 dS所致反应值的比值<0.5 时，判定供试品的降压物质检查符合规定。否则应按上述次序继续注射一组 4 个剂量，并按相同方法分别比较两组内 dS、 dT剂量所致的反应值；如 dT所致的反应值均不大于dS所致的反应值，即 dT与 dS所致反应值的比值<1时，仍判定供试品的降压物质检查符合规定；如 dT所致的反应值均大于 dS所致的反应值，即 dT与 dS所致反应值的比值>1 时，判定供试品的降压物质检查不符合规定；否则应另取动物复试。如复试的结果仍有 dT所致的反应值大于 dS所致的反应值，即 dT与 dS所致反应值的比值>1时，判定供试品的降压物质检查不符合规定。

1.4.2样品制备与色谱条件

1.4.2.1对照品衍生化

精密称取磷酸组胺对照品适量，用盐酸溶液(0.1 mol/L)溶解并稀释至1.00 mg/mL，4 ℃保存作为储备液。精密量取储备液适量，分别稀释至浓度为0.10，0.25，0.50，1.25，2.50，5.00，10.00 μg/mL，作为系列标准溶液。分别精密量取组胺系列标准溶液1 mL，置10 mL具塞试管中，加0.5 mL饱和碳酸钠溶液，混匀(pH9.0)，加入10 mg/mL丹磺酰氯丙酮溶液1.0 mL，振荡混匀约1 min，置60 ℃水浴避光反应30 min，中间振荡2次，取出加入氨水250 μL，混匀暗处放置30 min，加入乙醚2 mL，混匀，取乙醚层，再提取2次，合并乙醚层，40 ℃氮气吹干，加入1.00 mL乙腈溶解，0.45 μm滤膜过滤，待上样。

1.4.2.2供试品衍生化

精密量取心肌肽溶液适量，加入30 %三氯乙酸溶液使成含5%三氯乙酸的心肌肽溶液，漩涡混匀，8000 r/min， 4 ℃离心15 min，收集上清液，同对照品衍生化；另取样品加入组胺标准溶液使其终浓度分别为5.00，1.00，0.125 μg/mL同法制备，得样品加标溶液；取1份样品上清液用丙酮代替丹璜酰氯溶液制备供试品空白溶液。

1.4.2.3柱前衍生高效液相法的色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流动相：乙腈- 水；流速：1.0 mL/min，时间-梯度洗脱；柱温：30 ℃；检测波长：254 nm。见表1。

表1　梯度洗脱程序

1.4.3柱前衍生高效液相色谱法的方法学考察

1.4.3.1标准曲线的绘制

精密吸取组胺对照品衍生化溶液20 μL进样，测定组胺衍生物峰面积，以组胺浓度(C)为横坐标，峰面积(S)为纵坐标进行线性回归。

1.4.3.2加标回收率

以标准曲线法计算组胺的浓度，求得回收率。

1.4.3.3精密度

以1 d内测得的同一对照品衍生化溶液(5 μg/mL)的浓度计算日内精密度，以1周内6 d测得同一对照品衍生化溶液(5 μg/mL)的浓度计算日间精密度。

1.4.3.4重复性

取心肌肽溶液，平行制备6份供试品衍生化溶液进行测定。

1.4.3.5专属性

分别取对照品衍生化溶液、供试品衍生化溶液及供试品空白溶液20 μL进样测定。

1.4.4心肌肽中组胺含量的测定

分别精密吸取5 批心肌肽溶液的衍生化溶液20 μL进样，测定组胺衍生物峰面积，以标准曲线法计算组胺含量。

1.5统计学方法

数据用SPSS软件进行处理，以样品中组胺含量为横坐标(C)，以其所致的降压反应(dT/dS)为纵坐标进行线性回归，P<0.05为具有统计学意义。

2结果

2.1降压反应

1号样品符合规定，2、3号样品经复试后，判定为合格；4、5号样品换猫复试，4号样品经换猫复试为合格。见表2。

2.2柱前衍生高效液相色谱法的方法学考察

2.2.1标准曲线的绘制

回归方程为S=0.9925C+ 2.9264，r=0.996；线性范围：0.1～10 μg/mL；检测限为0.03 μg/mL，S/N≥3；定量限为0.1 μg/mL，S/N≥10。

2.2.2加标回收率

表2　 降压物质检查法的结果

结果表明，高(5.00 μg/mL)、中(1.00 μg/mL)、低(0.125 μg/mL)3 个浓度的组胺回收率均>91.1 %。

2.2.3精密度

结果表明，日内与日间精密度RSD 均<1.0%，符合生物样品的分析要求。

2.2.4重复性

6份供试品中组胺的平均含量为0.24 μg/mg，RSD为1.5 %。

2.2.5专属性

对照品和供试品衍生化溶液中可检出组胺，供试品空白溶液均未检出组胺(图1)。

2.3心肌肽中组胺含量的测定

5 批心肌肽溶液的组胺含量分别为0.04,0.17,0.24,0.25,0.34 μg/mg，SD值均<0.03。

2.4降压物质检查法与柱前衍生化高效液相法结果的相关性分析

回归方程为C=0.301X- 0.031，r=0.974，P=0.036。通过回归方程计算得，当组胺浓度控制在0.12 μg/mg以下时，降压反应比值(dT/dS)可控制在0.5以下，降压物质检查无需复试即可符合规定，当组胺浓度控制在0.27 μg/mg以下时，降压反应比值(dT/dS)可控制在1.0以下，降压物质检查需复试方可判定为符合规定。

3讨论

本实验通过采用建立的方法对引起不同降压反应的心肌肽原料药中的组胺进行了测定， 5批样品中组胺含量在0.04 ～ 0.34 μg/mg之间。进一步采用该方法考察了心肌肽原料药在室温条件下放置1周时组胺的含量变化情况。结果发现，心肌肽原料药在密封条件下组胺含量不受影响，表明心肌肽原料药中的组胺成分具有一定的稳定性。

本实验研究了常规的降压物质检查法中不同批次心肌肽所致的降压反应比值(dT/dS)与心肌肽溶液中组胺的含量相关性，结果提示二者呈良好的正相关，如果设定心肌肽溶液中组胺含量的限值为0.27 μg/mg ，降压反应比值(dT/dS)可控制在1.0以下。实验结果表明，该方法满足替代方法的要求，可以定量准确检测心肌肽中的组胺含量。通过扩大样本数进一步考察组胺含量和猫降压反应的相关性，设定组胺的含量限值，该方法可能作为心肌肽猫降压检查的良好方法。此方法重复性好，准确度高，可避免因动物个体差异大导致实验的准确性和重复性差的问题。

图1　高效液相法色谱图Fig 1 HPLC chromatogramsA：组胺对照品衍生化；B：心肌肽衍生化；C：心肌肽空白对照

参考文献:

[1] Wohrl S, Hemmer W, Focke M, et al. Histamine intolerance-like symptoms in healthy volunteers after oral provocation with liquid histamine [J]. Allergy and Asthma Proceedings, 2004, 25(5): 305-311.

[2] Rapaport MH. Dietary restrictions and drug interactions with monoamine oxidase inhibitors: the state of the art [J]. The Journal of Clinical Psychiatry, 2007, 68(8): 42-46.

[3] Chen HC, Huang YR, Hsu H, et al. Determination of histamine and biogenic amines in fish cubes (Tetrapturus angustirostris) implicated in a food-borne poisoning [J]. Food Control, 2010, 21(1): 13-18.

[4] 郑小蓉,林金秀.降压治疗须把握的两个“度”[J]. 中华高血压杂志, 2009, 17(12):1136-1139.

[5] 张红,徐建华,张玉风,等.冷血高钾停跳液中镁离子浓度对换瓣术心肌的影响[J]. 郑州大学学报(医学版), 2004, 39(4): 655-657.

[6] 张明辉,阮英茆,王清峙,等. 大鼠心肌缺血再灌注损伤与心肌肽素的保护作用 [J]. 中国临床康复, 2005, 9(23) : 86-88.

[7] Octavian B, Alexandru LS, Daniela M, et al. Validation study of a HPLC method able to measure biogenic amines in chicken meat [J]. Food Technol, 2008, New Series II (XXXI), 44-50.

[8] 翟红蕾,杨贤庆,郝淑贤. 生物胺高效液相色谱法测定条件的选择与优化 [J]. 食品科学, 2011, 18(32): 180-184.

[9] 邢丽红,冷凯良,孙伟红,等. 高效液相色谱-紫外检测法测定水产品中组胺的含量[J]. 安徽农业科学，2011, 39(13): 7832-7834, 7863.

[10] 中国药典委员会. 《中国药典》四部[M] . 北京：中国医药科技出版社, 2015: 通则1145.

作者简介:矫 建(1984-)，女，辽宁大连人，主管药师。E-mail：jiaojian91@aliyun.com 通信作者:鲁 军，副主任药师。E-mail：261748914@qq.com

doi:论著10.11724/jdmu.2016.03.05

[中图分类号]R932-33

[文献标志码]A

文章编号：1671-7295(2016)03-0228-04

(收稿日期:2016-03-29;修回日期:2016-03-30)

Feasibility analysis of HPLC detecting histamine content in cardiomyopeptide

JIAO Jian1, ZHANG Ting-ting1, DU Juan2, LIU Jin-peng1， LU Jun1

(1.DalianInstituteforDrugControl，Dalian116021，China；2.DalianSecondPeople’sHospital，Dalian116011，China)

[Abstract]Objective To establish and validate a method to determine histamine content in Cardiomyopeptide. Methods HPLC procedures employing derivatization reagents, dansylchloride were applied for determination of histamine in cardiomyopeptide. the supernatant derivatisation with dansylchloride was performed after cardiomyopeptide solution precipitated by Trichloroacetic acid(TCA)，the histamine was determined by a gradient elution HPLC method on a C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) with a mobile phase consisting of acetonitrile and water and detection at 254 nm. The method was validated in terms of linearity, precision，accuracy and recovery. Drop of blood pressure in cats caused by cardiomyopeptide was meassued with BIOPAC MP100 system. Results The method showed excellent linearity in the range 0.1-10 μg/mL，and the resulting correlation coefficients for histamine in the calibration range were 0.996，a limit of detection (LOD) of 0.03 μg/mL could be achieved，mean recovery rate was more than 91.1%，statistical analysis showed a good linear relationship between histamine content and the ratio of blood pressure dropping(dT / dS) (r=0.974，P=0.036). Conclusion The HPLC method was appropriate for the determination of histamine content in Cardiomyopeptide, which suggested the method could be a suitable alternative to conventional method in vivo experiments.

[Key words]depressor substance；cardiomyopeptide；histamine；HPLC；dansyl chloride pre-column derivatization