Caveolin-1在结直肠癌组织间质中的表达及临床意义

赵志韩方海



•论著•

Caveolin-1在结直肠癌组织间质中的表达及临床意义

赵志1韩方海2

【摘要】目的 探讨小凹蛋白（Caveolin-1，Cav-1）在结直肠癌组织中的表达及临床意义。方法 收集在我院手术的结直肠癌患者110例，用免疫组化的方法检测Cav-1蛋白的表达。结果 Cav-1阳性表达于肿瘤细胞的胞浆或胞膜上，低表达样本51例，高表达样本59例。Cav-1蛋白的表达与肿瘤N分期（P=0.011）及TNM分期密切相关（P=0.031）。Cav-1低表达患者的总体生存率及无进展生存率明显优于Cav-1高表达患者（P均小于0.001）。结论 Cav-1或可以作为估计结直肠癌患者预后的指标之一，这也可能为结直肠癌患者的治疗提高新的方向。

【关键词】结直肠肿瘤； 预后； 小凹蛋白

结直肠癌作为一种常见肿瘤是主要危害公众健康的疾病之一。据文献报道，在全球，每年约有120万患者被诊断为结直肠癌，并且其主要发病率位于西方国家，在美国，每年约有142 820例新增加结直肠癌的患者，死亡高达50 830例［1］。在过去的数十年中，随着TME手术及CME手术的推广及化疗药物的不断进步，使得结直肠癌的生存率不断提高，但仍有大约50%的病人术后出现复发，约有30%～40%的患者死于远处转移［2］。

近年来，研究发现肿瘤微环境在肿瘤的发生、发展中有着重要的作用。肿瘤微环境由免疫细胞、间质细胞、脂肪细胞、骨髓来源的前细胞及脉管系统组成。在正常生理情况下，间质作为一种防御组织能够预防恶性肿瘤的形成；但在恶性肿瘤形成的环境下，间质细胞却可以促进肿瘤细胞的发生、发展和转移。

小凹（caveolae）是细胞表面50 nm～100 nm大小的凹陷。Caveolae大量存在于内皮细胞、脂肪细胞、血管平滑肌细胞、纤维母细胞和肺上皮细胞。随着分子生物学研究的进展，发现caveolae参与许多细胞生命活动，例如：细胞内吞、细胞膜形成、信号传导和肿瘤生成。Caveolae蛋白家族有3个亚家族，分别是：Caveolin-1，Caveolin-2及Caveolin-3。Caveolin-1（Cav-1）基因位于染色体7（7q31.1），包括3个外显子和2个内含子。近年来的研究发现Cav-1表达在不同的肿瘤组织中都有表达，且Cav-1的表达与肿瘤的种类相关，在不同的肿瘤中，其表达不一［3］。在胰腺癌及食管癌中，Cav-1处于高表达，并且高表达患者预后较好，这说明Cav-1起抑癌作用［3-4］，而在另外一些肿瘤中，如子宫癌，乳腺癌中，Cav-1起着促癌作用［5-6］。除此之外，Cav-1被敲除的小鼠模型更容易被诱导肿瘤的形成［7］。相反，Cav-1在肾脏、胆囊中的表达升高且具有肿瘤分期的依赖性［8］，这充分说明Cav-1在肿瘤中的作用具有细胞属性。而且，Cav-1在肿瘤中的作用尚有争议，一些文献报道Cav-1在肿瘤细胞中表达与预后有着密切的关系；相反，El-Gendi等［9］报道Cav-1在肿瘤细胞中表达与预后无密切的关联。但是，近来有文献报道Cav-1在乳腺癌、前列腺癌及其他肿瘤间质中的缺失与肿瘤复发、转移及差的预后有着密切的关系［9-11］。

但是，目前对于Cav-1在结肠癌中的表达及其临床意义报道较少，本研究的目的就在于探讨Cav-1在结肠癌中的表达及与临床病理及预后的关系。

资料与方法

一、一般资料

选取2004年1月至2010年10月在中山大学孙逸仙纪念医院胃肠外科接受手术的结直肠患者110例，其纳入标准如下：①病理学证实为肠癌；②术前未接受新辅助治疗；③无多发性肿瘤；④术后根据NCCN接受完整的化疗；⑤术后随访资料完整。病人术后病理分期按照AJCC推荐的第七版指南分期。

二、结直肠癌组织及癌旁组织的获取

选取2004年1月至2010年10月术前在中山大学孙逸仙纪念医院活检并且病理证实为结直肠癌的病人的癌组织标本，其病人的纳入标准如上，癌旁组织为距肿瘤10 cm的正常组织。

三、试剂

Cav-1 兔抗人单克隆抗体购自Cell signal technology （CST）公司，工作浓度为1：100，二抗试剂盒、一抗稀释液、苏木素及 DAB 显色液等均购买自康为试剂公司。

四、免疫组化方法

将4微米厚的石蜡切片在65℃的烤箱烤2小时后，在梯度二甲苯中依次脱蜡，每次10分钟；脱蜡后，在梯度酒精中水化后放入双蒸水中10分钟，完毕后切片放入柠檬酸修复液（PH6.0）并置于高压锅中煮沸5分钟，将切片冷至室温后，放入3%的过氧化氢封闭内源性过氧化物15分钟，PBS漂洗三次，滴加1：100 d的Cav-1一抗，并置于4℃过夜，PBS 清洗，滴加羊抗兔二抗，室温下孵育20分钟，PBS漂洗，然后滴加 DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。

五、结果判断

由独立的2位病理科医生阅片，Cav-1的结果由肿瘤细胞的表达强度及表达面积联合评判，其评分标准如下：染色面积，0分，0%～10%；1分，10%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～70%；4分，＞70%。染色强度，0分，阴性；1分，浅黄色；2分，棕黄色。染色面积加染色强度0～4分者定义为低表达；4分或4分以上定义为高表达。

六、Western blot检测蛋白的表达

将细胞用消化酶消化后收集，置于冰上加入100～150 μl裂解液15分钟，然后移入到1.5 ml EP管中于4℃，12000 rmp的离心机离心10～15分钟，提取上清移入离心管中放入沸水中煮5 min，BCA法测定蛋白浓度。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶的浓度为10%，上样浓度为40 μg。然后以恒压60 V电泳约半小时，待溴酚蓝到达分离胶时，改用100 V恒压直至溴酚蓝电泳至分离胶底部，停止电泳。转膜，染色，洗脱，封闭，常温下孵育2 h后分别加入稀释的抗体；4℃孵育过夜，漂洗，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗；室温下孵育1 h，TBST洗3次，加入ECL发光液后放入机器曝光。

七、统计学分析

采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，用卡方检验比较不同临床病理特征的Cav-1的表达；Kapian-meier方法分析患者的生存情况；多变量生存分析采用Cox回归模型，P值＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

本研究共纳入110例病人，在这110例病人中，69例男性和41例女性。中位年龄53岁（25岁～77岁）。中位随访时间35个月（8个月～94个月）。

一、Cav-1在结直肠癌组织间质中的表达及与临床病理之间的关系

Cav-1阳性表达的黄色或棕黄色颗粒位于肿瘤间质中的脂肪细胞、内皮细胞及神经周围细胞（图1），其中29例样本阴性表达，84例样本阳性表达。在这113例样本中，低表达样本51例，高表达样本59例。Cav-1蛋白的表达及与各临床病理指标的关系见表1。如表所示，Cav-1蛋白的表达与N分期（P=0.011）及肿瘤TNM分期密切相关（P=0.031），但与年龄，性别，肿瘤大小，T分期，Borrmann分型及组织分化类型无密切关系。

图1 Cav-1蛋白在结直肠癌组织中的表达

二、Cav-1与患者预后

如图2所示，Cav-1低表达患者的总体生存和无进展生存明显差于Cav-1高表达患者（二者P＜0.001）。在Cox多因素回归模型中，Cav-1也同样被证明为总体生存独立的预后不良因素（P＜0.001）见表2。

表1 Cav-1蛋白表达与患者临床病理的关系表

三、Cav-1在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达

如图3所示，我们共选择了4对癌组织和癌旁正常组织。经Western blot证明，Cav-1在肿瘤组织中的表达明显低于癌旁正常组织。

讨 论

在我们的实验中，我们发现了Cav-1蛋白在结直肠癌组织间质中的缺失，并且Cav-1蛋白的表达与肿瘤的TNM分期和N分期有着密切的关系。同时，Kapian-meier分析显示Cav-1蛋白表达高的患者与低表达患者相比，其预后也较好。并且在Cox多因素生存分析中，Cav-1也保留了其独立性。这说明了Cav-1蛋白的表达缺失在肿瘤细胞具有促进肿瘤发生、发展的作用。并且，Cav-1可以作为独立的预后因素。这些研究结果与以往的研究结果相同。

图2 Kapian-meier方法分析患者的生存情况

Cav-1是小凹蛋白家族中的一员，并在众多细胞广泛表达。近来的研究表明，Cav-1 在肿瘤发生过程中既有抑癌效应，又有致癌作用［12-13］。Joo HJ等［12］的研究显示Cav-1表达的密度与肾癌的大小，TNM分期，分级，微血管密度转移及差的预后有极大的关联。Barresi V等［14］实验表明在脑膜瘤中Cav-1的表达与微血管的密度存在正相关。Moon KC等［15］实验表明在肺癌中Cav-1低表达与差的总体生存相关。Choi HN等［16］实验表明与癌旁组织相比，癌组织中的Cav-1 mRNA的水平明显增高。除此之外，Zhou H等［17］通过对不同小鼠肝癌模型中的Cav-1表达的研究发现Cav-1可促进肝癌的形成，其促进作用主要是通过调节肿瘤的生长及VEGF的形成。Zhao X等［18］发现Cav-1可通过调节TRAIL负性调节HepG2细胞的凋亡。这些证据表明Cav-1不仅起到抑癌作用还可以起到促癌作用。

表2 单因素和多因素分析结直肠癌患者预后的因素表

图3 Western blot检测Cav-1在结直肠癌组织中的表达

在我们的实验中，我们发现Cav-1的表达与淋巴结转移相关。因此，Cav-1的状态可能可以作为淋巴结受浸润的预测因子。Cav-1在活检组织中的表达情况对于早期结直肠癌来说可能可以拿来作为患者是否能接受经内镜切除的判断标准之一。而且，考虑到Cav-1的表达与患者的淋巴结转移相关，因此，Cav-1的表达情况对于无淋巴结转移的患者术后选择化疗具有重要意义。

我们还发现，Cav-1的表达与肿瘤的分期具有密切相关。患者Cav-1的表达缺失可能预示着患者的分期越晚。这个结果强调了Cav-1的在评估患者预后及化疗药物选择上的作用。因为，分期越晚，其预后越差，而且选择化疗更具有必要性。

除此之外，我们还发现Cav-1的表达情况与患者的预后具有密切的关联。Ho cc等［19］发现在非小细胞肺癌中，Cav-1的表达情况与患者的药物抵抗及预后具有密切关联。Satoh t等［20］发现Cav-1的表达与胆囊癌的分级具有密切关联。Tang y等［21］发现在肝癌中Cav-1的表达与预后具有重要的关联。这些实验结果都我们的结果一样。因此，Cav-1的表达可能能够作为结直肠癌患者的预后预测因子之一。

总之，本研究结果表明Cav-1在结直肠癌中的表达与淋巴结分级、TNM分期及预后密切相关，因此Cav-1可能会成为判定肿瘤预后的因素之一。

参 考 文 献

［ 1 ］ Siegel R， Naishadham D， Jemal A. Cancer statistics， 2013. CA： a cancer journal for clinicians， 2013， 63（1）： 11-30.

［ 2 ］ Sinclair P， Singh A， Riaz AA， et al. An unsolved conundrum： the ideal follow-up strategy after curative surgery for colorectal cancer. Gastrointestinal endoscopy， 2012， 75（5）： 1072-1079.

［ 3 ］ Kato K， Hida Y， Miyamoto M， et al. Overexpression of caveolin-1 in esophageal squamous cell carcinoma correlates with lymph node metastasis and pathologic stage. Cancer， 2002， 94（4）： 929-933.

［ 4 ］ Suzuoki M， Miyamoto M， Kato K， et al. Impact of caveolin-1 expression on prognosis of pancreatic ductal adenocarcinoma. British journal of cancer， 2002， 87（10）： 1140-1144.

［ 5 ］ Cokakli M， Erdal E， Nart D， et al. Differential expression of Caveolin-1 in hepatocellular carcinoma： correlation with differentiation state， motility and invasion， BMC cancer， 2009； 9： 65.

［ 6 ］ Zhang ZB， Cai L， Zheng SG， et al. Overexpression of caveolin-1 in hepatocellular carcinoma with metastasis and worse prognosis：correlation with vascular endothelial growth factor， microvessel density and unpaired artery. Pathology oncology research： POR，2009， 15（3）： 495-502.

［ 7 ］ Capozza F， Williams TM， Schubert W， et al. Absence of caveolin-1 sensitizes mouse skin to carcinogen-induced epidermal hyperplasia and tumor formation. The American journal of pathology， 2003， 162（6）： 2029-2039.

［ 8 ］ Goetz JG， Lajoie P， Wiseman SM， et al. Caveolin-1 in tumor progression： the good， the bad and the ugly. Cancer metastasis reviews， 2008， 27（4）： 715-735.

［ 9 ］ El-Gendi SM， Mostafa MF， El-Gendi AM. Stromal caveolin-1 expression in breast carcinoma. Correlation with early tumor recurrence and clinical outcome. Pathology oncology research ： POR， 2012， 18（2）：459-469.

［ 10 ］ Elsheikh SE， Green AR， Rakha EA， et al. Caveolin 1 and Caveolin 2 are associated with breast cancer basal-like and triple-negative immunophenotype. British journal of cancer， 2008， 99（2）： 327-334.

［ 11 ］ Karam JA， Lotan Y， Roehrborn CG， et al. Caveolin-1 overexpression is associated with aggressive prostate cancer recurrence. The Prostate， 2007， 67（6）： 614-622.

［ 12 ］ Joo HJ， Oh DK， Kim YS， et al. Increased expression of caveolin-1 and microvessel density correlates with metastasis and poor prognosis in clear cell renal cell carcinoma. BJU Int， 2004， 93（3）： 291-296.

［ 13 ］ Razani B， Altschuler Y， Zhu L， et al. Caveolin-1 expression is down-regulated in cells transformed by the human papilloma virus in a p53-dependent manner. Replacement of caveolin-1 expression suppresses HPV-mediated cell transformation. Biochemistry， 2000，39（45）： 13916-13924.

［ 14 ］ Barresi V， Cerasoli S， Tuccari G. Correlative evidence that tumor cell-derived caveolin-1 mediates angiogenesis in meningiomas. Neuropathology ： official journal of the Japanese Society of Neuropathology， 2008， 28（5）： 472-478 .

［ 15 ］ Moon KC， Lee GK， Yoo SH， et al. Expression of caveolin-1 in pleomorphic carcinoma of the lung is correlated with a poor prognosis. Anticancer research，2005， 25（6C）： 4631-4637.

［ 16 ］ Choi HN， Kim KR， Park HS， et al. Expression of caveolin in hepatocellular carcinoma： association with unpaired artery formation and radiologic findings. The Korean journal of hepatology， 2007，13（3）： 396-408.

［ 17 ］ Zhou H， Jia L， Wang S， et al. Divergent expression and roles for caveolin-1 in mouse hepatocarcinoma cell lines with varying invasive ability. Biochem Biophys Res Commun， 2006， 345（1）： 486-494.

［ 18 ］ Zhao X， Liu Y， Ma Q， et al. Caveolin-1 negatively regulates TRAIL-induced apoptosis in human hepatocarcinoma cells. Biochem Biophys Res Commun， 2009， 378（1）： 21-26.

［ 19 ］ Ho CC， Kuo SH， Huang PH， et al. Caveolin-1 expression is significantly associated with drug resistance and poor prognosis in advanced non-small cell lung cancer patients treated with gemcitabine-based chemotherapy. Lung cancer， 2008， 59（1）： 105-110.

［ 20 ］ Satoh T， Yang G， Egawa S， et al. Caveolin-1 expression is a predictor of recurrence-free survival in pT2N0 prostate carcinoma diagnosed in Japanese patients. Cancer， 2003， 97（5）： 1225-1233.

［ 21 ］ Tang Y， Zeng X， He F， et al. Caveolin-1 is related to invasion，survival， and poor prognosis in hepatocellular cancer. Medical oncology， 2012， 29（2）： 977-984.

（本文编辑：杨明）

赵志， 韩方海. Caveolin-1在结直肠癌组织间质中的表达及临床意义［J/CD］. 中华结直肠疾病电子杂志， 2016， 5（1）：47-51.

The expression and clinical significance of caveolin-1 in colorectal cancer stroma

Zhao Zhi， Han Fangha i.1Department of Gastrointestinal Surgery， Guilin Medical College Affiliated Hospital， Guilin 541000，China；2Department of Gastrointestinal Surgery，Sun Yat-Sen Memorial Hospital， Sun Yat-Sen University，Guangzhou 510120， China
Corresponding author:Han Fanghai， Email: FH_Han@163.com

【Abstract】Objective To investigate the clinicopathological significance and prognostic value of Caveolin-1 （Cav-1） in colorectal cancer （CRC）. Methods A total of 110 patients with CRC were included in this study. The correlation between Cav-1 expression and clinicopathologic features and survival was studied. Results Cav-1 expression was detected in tumor cytoplasm and cytomembrane. The expression of Cav-1 was closely associated with pathologic （p） TNM stage （P=0.037） and pN stage （P=0.011）. Moreover， Kaplan-Meier analysis showed that high Cav-1 expression was associated with shorter overall survival and disease free survival （P＜0.001 for both）. Multivariate analysis revealed that the Cav-1 expression was an independent prognostic factor for overall survival （P＜ 0.014）. Conclusion The expression of Cav-1 in CRC was associated with poor prognosis and could be a prognostic factor for CRC patients.

【Key words】Colorectal neoplasms； Prognosis； Caveolin-1

DOI：10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2016.01.09

基金项目：国家自然科学基金（81572925）

作者单位：541000 桂林医学院附属医院胃肠外科1；510120 广州，中山大学孙逸仙纪念医院胃肠外科2

通信作者：韩方海，Email：FH_Han@163.com

收稿日期：（2016-1-18）