中期因子和微血管密度在涎腺腺样囊性癌组织中的表达

陈俊  李姬梅  李伟  胡红梅.井冈山大学附属医院口腔科，吉安 4000；.江西省吉水县人民医院妇产科，吉水 600 .井冈山大学医学院解剖学与组织胚胎学教研室，吉安 4000



中期因子和微血管密度在涎腺腺样囊性癌组织中的表达

陈俊1李姬梅2李伟1胡红梅3
1.井冈山大学附属医院口腔科，吉安 343000；2.江西省吉水县人民医院妇产科，吉水 331600 3.井冈山大学医学院解剖学与组织胚胎学教研室，吉安 343000

[摘要]目的 探讨中期因子（MK）、微血管密度（MVD）在涎腺腺样囊性癌（SACC）组织中的表达和意义，以及两者之间表达的相关性。方法 采用免疫组织化学方法（SP法）检测60例SACC组织及26例正常涎腺组织中MK、MVD的表达状况及两者之间的相关性。结果 MK在SACC组织中高表达，阳性表达率为70.0%（42/60），正常组织中未见MK表达，二者间差异有统计学意义（P＜0.05）。SACC中MVD计数为38.73±8.96，正常涎腺组织中MVD计数为11.15±3.33，二者间差异有统计学意义（P＜0.05）。MK、MVD的表达与年龄、性别、分型无关（P＞0.05）；与肿瘤的大小、淋巴结转移、TNM分期有关（P＜0.05）。MK和MVD在SACC中的表达具有正相关性（r=0.560，P＜0.05）。结论 MK蛋白的表达、MVD计数的增加与SACC的发生有关，可能是SACC早期诊断指标之一。

[关键词]涎腺腺样囊性癌； 中期因子； 微血管密度； 免疫组织化学； 涎腺

涎腺肿瘤（salivary gland tumors，SGT）是口腔颌面部常见的肿瘤，以中老年居多，在全球范围内涎腺肿瘤的发病率居全身肿瘤的1%~4%[1-2]。涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）过去曾称“圆柱瘤”（cylindroma），是最常见的唾液腺恶性肿瘤之一，临床病理已证实，此肿瘤浸润性极强，易沿神经扩散，易侵入血管，常造成血行性转移。中期因子（midkine，MK）是近来新发现的一种自分泌型肝素结合生长因子，在乳腺癌、肺癌、胃癌、宫颈癌、骨髓瘤、口腔鳞状细胞癌等多种恶性肿瘤中，MK均呈高表达，并且证实与肿瘤血管新生有密切关系。微血管密度（microvessel density，MVD）1992年由Weidner等[3]报道，它是用来计数肿瘤内血管生成的数量。但MK和MVD在SACC中的相关报道较少。本研究旨在通过研究MK与MVD 在SACC中的表达是否具有相关性，来探讨MK在促进肿瘤血管生成中的作用以及肿瘤微血管与肿瘤本身的关系。

1  材料和方法

1.1  标本来源

标本来源于南昌大学附属口腔医院口腔颌面外科2001年1月—2011年8月手术切除并经病理证实的60例SACC组织和26例正常涎腺组织。SACC患者中男性25例，女性35例，年龄17~80岁，平均年龄为50.4岁；根据肿瘤生长部位，其中舌下腺16例，腭腺14例，下颌下腺6例，腮腺13例，磨牙后腺11例；有淋巴结转移9例，无淋巴结转移有51例。根据2005年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）唾液腺肿瘤组织病理学分类标准，对60例SACC进行病理分类，其中筛状型20例，管状型21例，实性型19例；通过病理分级检测瘤组织的成熟程度，其中高分化20例，中分化25例，低分化15例；按2002年国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control，UICC）涎腺癌国际标准，对60例SACC作TNM分期，其中T1为17例，T2为22例，T3+T4为21例。所有患者术前均未接受放化疗。

1.2  试剂

MK兔抗人多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；MVD鼠抗人单克隆抗体、SP试剂盒及DAB（福建迈新生物技术有限公司）。

1.3  方法

所有标本均经4%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片4张，MK蛋白和由CD34标记的MVD均采用免疫组织化学SP法，MK的工作浓度1︰500，DAB染色，实验程序按试剂盒说明进行，PBS代替一抗空白对照。

1.4  结果判定

1.4.1   MK的结果判定标准   MK蛋白在肿瘤细胞浆和（或）细胞膜中表达，判定阳性反应依据以下两个方面：1）按显色强度：细胞无染色记0分，呈黄色记1分，呈棕黄色记2分，呈棕褐色记3分；2）按阳性细胞百分比评分：按光镜下（×400）随机选10个视野，每个视野计数100个细胞。计数细胞若＜25% 为1分，25%~50%为2分，＞50%为3分；两个方面的乘积＞3分计为阳性，≤3分计为阴性。

1.4.2  CD34的结果判定及血管计数方法  用Weidner 等[3]报道的方法，阳性标准为：1）每1个染成棕黄色的，可以与周围血管、肿瘤细胞及其他结缔组织相分离的血管内皮细胞或内皮细胞簇，认定为1个单一的计数的微血管。2）可能源于同一微血管的内皮细胞，如染色清晰且相互分离，也可作为单独的微血管计数。3）血管腔内有无红细胞不是确认微血管的必备条件。4）对肿瘤细胞稀疏区及邻近良性组织区域内的血管不进行计数。5）对管腔直径＞10个红细胞的血管不进行计数。计数方法：先在低倍镜下（×40）观察整个切片，寻找高血管密度区，即“热点”，然后在高倍镜下（×200）计数被染成棕黄色的血管数目，再计数4个高倍镜视野下血管的数目，此操作由两个人采用双盲法执行，取两人计数结果的平均值作为MVD列入分析。

1.5  统计学方法

采用SPSS 17.0软件对实验数据进行分析，对实验结果采用卡方检验和（或）精确概率计算法，对相关性采用Spearman相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2  结果

在60例SACC中，MK阳性表达者42例，阳性表达率为70.0%（42/60）；正常涎腺组织中未见MK阳性表达，二者间差异有统计学意义（χ2=51，P= 0.00）。在癌细胞中，MK主要位于细胞浆及核膜，呈黄色或棕黄色颗粒状物质（图1）。

图  1  MK在SACC组织中呈阳性表达  SP  × 400Fig 1  The positive expression of MK in SACC  SP  × 400

CD34标记的MVD染色主要是定位于新形成血管的内皮上，呈黄色或棕黄色，肿瘤灶的边缘处为染色最密集的区域，显微镜下观察，有些SACC的新生血管已经形成了管腔样结构，有些新生的血管的内皮细胞只是呈星点状或线条状分布，MVD在SACC组织中呈阳性表达（图2、3）。SACC中MVD计数（38.73±8.96）明显高于正常涎腺组织（11.15± 3.33），二者间差异有统计学意义（t=15.920，P= 0.00）。

图  2  MVD在SACC组织中呈阳性表达  SP  × 400Fig 2  The positive expression of MVD in SACC  SP  × 400

图  3  新生血管的形态与结构  SP  × 400Fig 3  The morphology and structure of neovascularization  SP  × 400

MK在SACC组织中的阳性表达与患者的年龄、性别、分型及肿瘤分布的部位无关（P＞0.05），而与肿瘤范围大小、淋巴结转移、TNM分期有关（均P＜0.05）；CD34标记的MVD计数与患者的年龄、性别、分型及肿瘤分布的部位无关（P＞0.05），而与肿瘤的大小、淋巴结转移、TNM分期有关（均P＜0.05）（表1）。

表  1  MK、MVD与SACC临床病理特征的关系Tab 1 Relationship between the expression of MK and MVD and clinical and pathological parameters of SACC

SACC组织中，MVD与MK的表达水平间存在正相关关系，相关系数r=0.560，有统计学意义（P＜0.05）。MK阳性表达病例为42例，MVD计数为40.23±6.67；MK阴性表达病例为18例，MVD计数为38.22±6.89，二者间的差异有统计学意义（t=36.459，P＜0.05）。

3  讨论

MK是近来新发现的一种肝素结合性生长因子家族成员之一，其功能首先被定位于神经系统中神经细胞的发育及分化[4]，以后人们发现在消化、呼吸、血液、生殖等诸多系统中都存在MK[5]，MK不仅与正常的生理有关，还与炎症、创伤及肿瘤等病态生理有关[6]。生理情况下，MK基因表达随个体发育而变化，在胚胎期高表达，出生后逐渐降低；在成年组织中，除肾脏和小肠上皮外，其他部位几乎不表达。近来许多研究[7-11]表明，MK mRNA在多种癌组织中呈高频率、高强度表达，这可能与肿瘤的发生发展及转移有关。超过60%的成人实体瘤患者的血清中均可检测到高水平的MK，当肿瘤切除后，再检测发现患者血清中MK浓度呈明显的下降。随后Ikematsu等[12]又报道，在膀胱癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、胃癌等恶性肿瘤患者的尿液中MK的质量浓度也明显升高。本实验发现，在SACC组织中MK呈高表达，而正常涎腺组织中未见MK的表达，MK可能作为SACC的一个诊断指标。MK的表达与临床分期和分化类型及淋巴结转移密切相关，表明随着临床分期和淋巴结的转移，MK的表达增强，提示MK的表达可能与肿瘤的发生、发展及淋巴结转移有关，所以，MK可能成为临床上评估SACC发展的指标之一。此外，本实验还分析了MK与SACC临床病理特征的关系，结果发现MK蛋白的表达与患者的年龄、性别、SACC的病理分型无相关性（P＞0.05）。本课题通过观察SACC的免疫组织化学染色切片发现，在SACC组织中癌细胞的胞浆及核膜是MK蛋白主要的分布区域，在核膜上高表达MK有可能进入到细胞核内，通过某些信号通路来调节细胞的增殖与分化功能，从而肿瘤的产生。

目前大多数研究认为，血管的新生有利于肿瘤的生长、浸润及转移。肿瘤组织中新生的血管基底膜较薄并且易断裂，肿瘤细胞很容易侵入血管内，继而通过血液途径而向远处转移。近年来，在研究肿瘤血管新生的报道中，所采用的血管内皮细胞标记物[13]中以CD34最具代表，CD34通常在增殖的血管内皮细胞和肿瘤组织内血管生成旺盛的血管内皮细胞中呈过表达，而在正常成熟的血管内皮细胞中通常呈弱表达或不表达[14]。本研究结果显示，SACC和正常涎腺组织比较，前者MVD值显著高于后者，差异有统计学意义（P＜0.05）。在显微镜下可观察到，肿瘤组织中不仅有血管数目增加，而且新生血管的形态和结构也有明显变化，主要表现在：新生血管大部分为发育不完善，管壁仅为一层内皮细胞，有些地方呈点隙裂状，缺乏基底膜。因此，可以推测SACC中血管新生的这些情况给肿瘤细胞的浸润及转移提供了阻力最小的通道，给SACC易发生血行性转移提供了有力的证据。此外，SACC的MVD值与淋巴结状态有关，淋巴结阴性组（36.41±4.32）高于阳性组（33.88±4.75），差异有统计学意义（P＜0.05），提示肿瘤细胞转移依赖于肿瘤血管的生成。本研究结果还发现，MK在SACC细胞外间质中的纤维组织、血管内弹力膜层及内皮细胞也有表达，提示MK可能具有刺激内皮细胞增殖、促进血管生成的作用，与Mashour等[15]报道相一致。另外，MK与MVD在SACC中的表达具有相关性，说明MK具有促进肿瘤血管生成的作用，也说明肿瘤微血管与肿瘤本身有密切关系。

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（本文编辑  杜冰）

[中图分类号]R 739.87

[文献标志码]A   [doi]   10.7518/hxkq.2016.02.017

[收稿日期]2015-07-13； [修回日期]  2015-11-03

[作者简介]陈俊，主治医师，硕士，E-mail：huhongmei1218@126.com

[通信作者]胡红梅，副教授，硕士，E-mail：huhongmei503@126.com

Expression of midkine and microvessel density in salivary adenoid cystic carcinoma

Chen Jun1, Li Jimei2, Li Wei1, Hu Hongmei3. (1. Dept. of Stomatology, The Affiliated Hospital of Jinggangshan University, Ji’an 343000, China; 2. Dept. of Gynaecology and Obstetrics, People’s Hospital of Jishui County, Jiangxi Province, Jishui 331600, China; 3. Dept. of Histology and Embryology, Medical College of Jinggangshan University, Ji’an 343000, China)
Correspondence: Hu Hongmei, E-mail: huhongmei503@126.com.

[Abstract]Objective This study aimed to investigate the expression of midkine (MK) and microvessel density (MVD) in patients with salivary adenoid cystic carcinoma (SACC) and its clinical significance, as well as detect the correlation between the expression of MK and MVD in SACC. Methods  Immunohistochemistry analysis (SP method) for MK and MVD were performed on 60 cases of SACC and 26 cases of normal salivary gland tissue. The expression of MK and MVD, as well as the correlation between the expression of MK and MVD in SACC were detected. Results   In SACC, the MK expression rate was 70.0% (42/60), and MK was not expressed in normal tissue. Statistical significance was found between SACC and normal tissue (P<0.05). The MVD values in SACC and normal salivary gland tissues were 38.73±8.96 and 11.15±3.33, respectively. These values were statistically significant (P<0.05). The expression levels of MK and MVD were unrelated to age, gender, and type in SACC (P>0.05), but correlated with tumor size, lymph node metastasis, and tumor–node–metastasis in SACC (P<0.05). The expression of MK and MVD was positively correlated with SACC (r=0.560, P<0.05). Conclusion SACC is correlated with the expression of MK protein and the increase in MVD, which may be some of the early diagnostic markers in SACC.

[Key words]salivary adenoid cystic carcinoma;  midkine;  microvessel density;  immunohistochemistry;  salivary gland